IFN-γ及其基因多态性与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的关联性研究

张萃萍，欧阳晓春

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院神经内科，南昌 330002)

急性一氧化碳中毒后迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)是指在急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning，ACMP)后，经过2～60 d的“假愈期”后部分患者再次出现一组以锥体系及锥体外系表现及痴呆等精神症状为主的脑功能障碍，给患者的家庭及社会造成很大负担，且DEACMP的发病机制复杂，目前尚无明确的结论。有研究[1]发现，血清免疫因子参与DEACMP的发病，本研究通过检测血浆干扰素-γ(IFN-γ)的水平及IFN-γ基因+874位点单核苷酸多态性，探讨IFN-γ水平及其基因多态性与DEACMP的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

病例来自中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院神经内科2016年2月至2019年2月收治的住院病例，均符合ACMP及DEACMP的诊断标准[2]。DEACMP患者30例(DEACMP组)，男16例，女14例，年龄13～74岁，平均年龄(42.6±12.2)岁，平均住院(20.5±4.5)d，昏迷持续时间为2～26 h，平均(8.4±4.3)h。ACMP后未发生迟发性脑病患者30例(ACMP组)，男17例，女13例；年龄11～78岁，平均(43.5±11.8)岁；昏迷持续时间为1～23 h，平均(8.1±4.1)h；其中毒方式及时间与DEACMP组相似。2组年龄、性别、昏迷时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

排除标准：1)接受过免疫抑制剂治疗;2)既往有糖尿病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、营养不良及精神疾病；3)近期有严重感染史；4)妊娠、哺乳及月经期妇女。

1.2 干扰素-γ+874基因多态性检测

1.2.1 引物设计与合成

从GENBANK下载人IFN-γ基因序列，应用Primer 5.0，针对+874 T→A多态性位点，由华大基因合成引物,序列如下：

IIFN-γ基因+874T→A(527 bp)

上游1：5′-TAT TCT TAC AAC ACA AAA TCA AAT CT -3′

上游2：5′-TAT TCT TAC AAC ACA AA A TCA AAT CA-3′

下游：5′-TTA TCC GCT ACA TCT GAA TGA C -3′

GAPDH引物序列(158 bp)

上游：5′-GTC AAG GCT GAG AAC GGG AA-3′

下游：5′-AAA TGA GCC CCA GCC TTC TC-3′

1.2.2 DNA提取

取ETDA抗凝静脉血2 mL，在-20 ℃条件下冻存，采用北京天根基因组提取试剂盒提取DNA,按说明进行。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR-SSP)条件

PCR扩增体系为25 μL，包括:2XTaq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板:2 μL，双蒸水加至25 μL。扩增条件:95 ℃预变性4 min后进入循环扩增,即先94 ℃变性30 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,重复10个循环后,再进入第2次循环,即:94 ℃变性30 s,50 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,重复23个循环后于72 ℃再延伸6 min。2%琼脂糖4.0 g·dL-1溴乙锭凝胶方法电泳(120 V 20 min),紫外透射自动成像分析仪成像。

1.3 IFN-γ水平检测

采用酶联免疫吸附法检测血浆细胞因子IFN-γ水平。用EDTA抗凝管收集患者外周静脉血2～3 mL，离心后取0.5～1.0 mL，-20 ℃冰箱中保存。ELISA试剂盒采用上海森雄科技实业有限公司，按使用说明书操作。

1.4 统计学方法

用SPSS13.0软件对数据进行处理。计数资料比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 IFN-γ+874位点多态性检测

IFN-γ+874 T→A多态性位点PCR扩增目的片段均为527 bp,此位点存在TT、TA、AA 3个基因型,GAPDH内参产物片段为158 bp。每两个孔道组成一个基因型，1/2泳道为杂合型TA型,3/4泳道为纯合TT型，5/6泳道为纯合AA型，7/8泳道为纯合TT型，见图1。

2.2 基因型频率分型

2组IFN-γ+874 T→A位点的平衡定律检验显示，IFN-γ+874 T→A位点TA、TT、AA 3个基因型组成T、A 2个等位基因，频率均符合遗传平衡法则(P>0.05)，见表1。

2.3 2组IFN-γ+874基因型及等位基因频率

DEACMP组IFN-γ+874位点TA、TT、AA基因型与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；DEACMP组T、A等位基因频率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4 2组血浆IFN-γ水平

DEACMP组血浆IFN-γ为(29.20±9.37)ng·L-1，ACMP组为(18.58±8.42)ng·L-1，DEACMP组血浆IFN-γ水平明显高于ACMP组(t=4.62,P<0.01)。

3 讨论

ACMP可造成以中枢神经系统功能损害为主的全身各组织细胞的损伤，在一氧化碳中毒患者中有较高的发病率，国外研究报道本病近10年发病率为20%～60%；国内发病率为0.2%～47.3%，重度ACMP患者可达10%～40%[3]。对患者的身体健康以及生命造成极为严重的影响，DEACMP可能的发病机制有缺血缺氧、自由基损伤、细胞毒性损伤、NO介导的损伤、细胞凋亡、内源性CO损伤等[4]，不过上述学说均不能很好地解释DEACMP的病理改变及临床表现，提示DEACMP的发病过程中可能还有其他机制共同参与其中。有研究[5-6]发现，对DEACMP患者多种血清免疫因子均出现明显变化，提示神经免疫因素参与了DEACMP的发病，IFN-γ来源于活化的单核巨噬细胞，可增强T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的活力而对机体起免疫调节作用，对细胞免疫应答和抗原呈递均有增强作用，本研究结果显示，DEACMP组血清IFN-γ水平明显高于ACMP组，2组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，提示DEACMP患者急性期血清IFN-γ水平明显增高，可能是影响迟发性脑病发生的危险因素，对于判定病情和评估预后具有一定的临床意义，但没有监测其在疾病发展过程的动态变化，其在迟发性脑病中如何发挥的作用尚不明确。

刘勇林等[7]研究表明，暴露时间和中毒后昏迷时间是DEACMP的发生的危险因素，但年龄、性别、暴露时间和中毒后昏迷时间相似的患者其预后有时也存在天壤之别，提示存在个体间的差异，推测可能受某些内在相关基因的影响。LI等[8]研究证实，在NRXN3基因中发现了DEACMP和特异性SNPs之间的相关性，提示DEACMP具有遗传易感性，DEACMP是环境因素与个体遗传背景相互作用的结果，但这方面研究极少，有待于发现更多可能存在的相关基因。不少缺氧性疾病与自身免疫损伤和髓鞘结构破坏存在关联[9-10]，而DEACMP头颅磁共振及病理特点提示脑白质的脱髓鞘改变，DEACMP与多发性硬化相类似，两者属于继发性脱髓鞘疾病，病理改变及临床表现具有诸多相似，此类疾病发病多集中在自身免疫损伤和髓鞘结构破坏环节，具有遗传易患性[11]。王慧词等[12]通过对MS基因组关联研究，发现IFN-γ基因多态性与多发性硬化易感性相关，故本实验选取年龄、性别、昏迷时间等基本条件无明显差别的DEACMP组及未发生DEACMP的ACMP组病例进行研究，结果表明，DEACMP组IFN-γ+874位点AA、AT、TT基因型数量分别为20、7、3，对应的ACMP组分别为18、10、2，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；DEACMP组A、T等位基因频率分别为43、17，ACMP组分别为39、21，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示IFN-γ+874基因多态性与DEACMP的遗传易感性之间没有相关性。

本研究中，DEACMP组与ACMP组IFN-γ+874位点AA、AT和TT基因分布无差异，提示IFN-γ基因多态性与DEACMP的发病无明显相关，在血液检测指标中，DEACMP患者IFN-γ明显高于ACMP组，说明一氧化碳中毒后迟发性脑病的发生与神经免疫损伤机制有关。目前认为IFN-γ+874A/T基因多态性不能作为DEACMP的预警指标，由于样本量较少,又存在地域和种族之间的差异,结果还有待进一步研究。