腹外侧中脑导水管灰质多巴胺受体参与丙泊酚麻醉的作用研究

张 益，杨银银，熊以强，蒲 青，赵燕飞，刘程曦

0 引 言

尽管全身麻醉药已在临床中广泛运用，但具体作用机制仍是未解之谜。近年的研究发现，全身麻醉与自然睡眠之间有较多相似之处，大脑中的睡眠觉醒通路同样也参与了全身麻醉的过程[1-3]。中脑导水管周围灰质是具有复杂功能的脑干核团，其中腹外侧中脑导水管灰质(ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG)在疼痛调节、防御行为、焦虑以及恐惧等行为等过程中发挥着重要的作用[4-6]。最新的研究发现，vlPAG是快速动眼(rapid eyes movement，REM)睡眠的重要调节脑区，通过特异性毁损或拮抗vlPAG的GABA能神经元可明显增加小鼠的REM睡眠时间，反之激活vlPAG的GABA能神经元几乎可以完全消除REM睡眠[7-8]。本课题组前期研究也发现[9]，特异性毁损vlPAG的多巴胺神经元缩短丙泊酚麻醉的诱导时间，同时延长其苏醒时间，说明了vlPAG在全身麻醉过程中扮演着重要的角色。vlPAG中各类神经元上均表达有丰富的多巴胺受体，可调节相应神经元的活性[10]，而vlPAG多巴胺能受体在全身麻醉中的作用目前仍未见报道，因此，本研究利用光纤钙信号记录、微注射和在体脑电记录观察vlPAG中多巴胺D1和D2受体在丙泊酚麻醉诱导和苏醒过程中的作用，并由此探究丙泊酚的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性SD大鼠60只，体重250～350 g,购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0011。饲养于贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室SPF级动物房。大鼠饲养于温度为22～25 ℃，相对湿度为 40%～60%，安静、通风及空气过滤系统良好的SPF环境中饲养，维持 12h/12h昼夜节律。

1.2主要仪器和试剂实验药物 1% 丙泊酚(Fresenius Kabi，国药准字 J20160089)、SKF-82958C(Sigma，C130-100MG)、SCH-23390(Sigma，D054-25MG)、喹吡罗盐酸(Sigma，Q102-100MG)、舒必利(Sigma，S8010-100G)、戊巴比妥(Merck，P11011)。

1.3光纤钙信号记录模型及实验

1.3.1 随机数字表法选取10只大鼠，大鼠经腹腔注射10%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉后，将其固定于脑立体定位仪，暴露颅骨并调平，参照第6版大鼠脑图谱定位仪于vlPAG(注射坐标：Bregma后7.5 mm，左右侧旁开0.6 mm，深度5.4 mm)注射病毒。以150 nL/min的速度吸取病毒(rAAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA)，以50 nL/min的速度注射 300 nL病毒到目的位点，注射针原位停留10 min。完成注射后将光纤陶瓷插芯放置在注射位点上方200 μm处并固定。完成后单笼饲养4周，待病毒转染。

1.3.2光纤钙信号记录实验首先1.5% 异氟醚吸入麻醉下行大鼠尾静脉穿刺置管，置管成功后将大鼠置于诱导箱内。待大鼠苏醒并自由活动1h后开始光纤钙信号记录。记录跳线与大鼠头部的陶瓷插芯连接后，记录大鼠稳定清醒状态的钙信号10 min，然后以11 mg/kg的剂量尾静脉单次注射丙泊酚，标记大鼠翻正反射消失(loss of right reflex，LORR)和翻正反射恢复(recovery of right reflex，RORR)，待大鼠翻正反射恢复后继续记录10 min。啮齿动物翻正反射的恢复及消失可以代表其麻醉意识的消失及恢复，因此本实验采用了LORR以及RORR作为判断大鼠麻醉诱导及苏醒的指标。

光纤钙信号记录的数据采用Matlab 2016a进行分析。以记录神经元钙信号荧光强度F和基线荧光强度F0的差值为分子，以基线荧光强度F0的值为分母，以ΔF/F[ΔF/F = (F-F0)/F0]反应丙泊酚引起的vlPAG神经元的荧光强度变化。麻醉诱导期间分析LORR时间点前后100s内vlPAG神经元在活性变化(清醒基线(-100～-50 s)、诱导期(-50～0 s)、麻醉早期(0～50 s)和麻醉期(50～100 s)。苏醒诱导期间分析RORR时间点前后100s内vlPAG神经元在活性变化(麻醉基线(-100～-50 s)、复苏期(-50～0 s)、苏醒早期(0～50 s)和苏醒后期(50～100 s)。

1.4微注射模型及实验

1.4.1 微注射模型建立按上述钙信号建模方法麻醉固定老鼠，于vlPAG埋置微注射双管套针，于前额叶(坐标：Bregma向前3.7 mm，右侧旁开2 mm，深度1.5 mm)埋置脑电记录电极，配置牙科水泥将套管针和电极固定于颅骨表面。待术后恢复 7 d，观察无行为学异常后进行行为和脑电实验。

1.4.2行为及脑电记录将vlPAG微注射模型大鼠随机数字表法分为5组：D1R激动剂组、D1R拮抗剂组、D2R激动剂组、D2R拮抗剂组和对照组，每组10只。按异氟醚麻醉下尾静脉置管，待大鼠苏醒，自由活动1 h后拔出导管芯并连接微注射内管。诱导期记录：麻醉前10 min，5组大鼠以100 mL/min的速度注射分别给予1 μL的 SKF-82958C、SCH-23390、喹吡罗盐酸、舒必利和等渗盐水后，尾静脉以60 mg/(kg·h)速度泵注丙泊酚，记录从泵注开始至翻正反射完全消失时间。苏醒期记录：诱导期记录后所有模型恢复3 d，以11 mg/kg剂量尾静脉单次注射丙泊酚，此后以50 mg/(kg·h)丙泊酚维持麻醉20 min，微注射相应药物后停止泵注丙泊酚，记录大鼠翻正反射记录恢复时间及全程记录皮层脑电。

1.4.3脑电分析皮层EEG数据经Sipke2软件滤波处理后分为 δ 波(1～4 Hz)、θ波(4～8 Hz)、α波(8～12 Hz)、β波(12～25 Hz)以及γ波(25～60 Hz)5个频段，分别比较在丙泊酚麻醉期间各组微注射给药前后各个频段波频率值的差异。

1.5组织学验证所有大鼠实验结束后，4%多聚甲醛溶液灌流固定组织，冰冻切片机切片(30 μm)。钙信号实验组大鼠于显微镜下观察，验证病毒注射及光纤埋置位置。微注射组经伊红染色后于体式显微镜下，观察微注射套管位置。参考第六版大鼠脑立体定位图谱，定位不正确以及有异常组织损伤的数据予以剔除并补充实验。

2 结 果

2.1微注射行为学和脑电结果与对照组相比，vlPAG微注射D1R激动剂组延长了丙泊酚麻醉的诱导时间，缩短了苏醒时间(P<0.05)。而D1R拮抗剂组则减少诱导时间，并延长苏醒时间(P<0.05); 但vlPAG微注射D2R激动剂和拮抗剂对丙泊酚麻醉诱导和苏醒时间均无明显影响(P>0.05),见表1。

表 1 微注射D1R激动剂/拮抗剂和D2R激动剂/拮抗剂对大鼠丙泊酚麻醉LORR和RORR的影响

2.2光纤钙信号记录在丙泊酚诱导翻正反射消失过程中，vlPAG神经元的钙信号较清醒基线明显降低(P<0.05)。在丙泊酚麻醉苏醒期间，与麻醉基线相比，vlPAG神经元的钙信号在复苏期、苏醒早期和苏醒后期钙信号显著增加(P<0.05),见图1。

a、b：分别为LORR时变化线图和统计图； c、d：分别为RORR时变化线图和统计图

与给药前相比，D1R激动剂组大鼠δ频段的能量明显降低(P<0.05)；D1R抑制剂组δ频段的能量显著增加(P<0.05)，同时β频段的能量明显增高(P<0.05)。给予D2R激动/拮抗剂对皮层脑电各频段均未产生明显的影响(P>0.05)。见表2。

表 2 丙泊酚麻醉下vlPAG微注射前后各组脑电结果比较

3 讨 论

光纤钙信号记录是通过测定神经元钙离子瞬变时产生的荧光强度来反映局部区域的神经元活动强度，是记录活体动物大脑深部结构神经元活动最灵敏、最简便的方法之一[11]。通过光纤钙信号技术，我们发现在丙泊酚诱导全身麻醉的过程中，vlPAG神经元的活性被显著抑制；在麻醉的苏醒阶段，vlPAG神经元又被显著激活，该结果说明vlPAG神经元的活性与麻醉效应之间存在明显的关联性。有研究表明，清醒时vlPAG神经元的c-fos表达量明显高于睡眠时期，提示vlPAG神经元活动可随意识状态的改变而变化[12-13]。这与我们观察到的结果相似。同时，我们前期研究也发现丙泊酚可以增加vlPAG神经元的抑制性突触后电流，使膜电位去极化，从而抑制vlPAG区域神经元活性[9]。这说明vlPAG神经元的活动受到了丙泊酚麻醉的调控。

为进一步研究vlPAG在丙泊酚麻醉中作用，我们采用微注射和脑电结合的方式探讨其具体作用机制。结果显示: vlPAG内微注射D1受体激动/拮抗剂，可以改变丙泊酚麻醉的诱导和苏醒时间，并且引起脑电改变；D2受体的激动剂或拮抗剂对丙泊酚麻醉均无明显作用，这表明vlPAG的D1受体参与调控丙泊酚麻醉。Solt等[14]之前的研究发现，大鼠静脉注射多巴胺转运体拮抗剂哌醋甲酯可加速异氟醚麻醉的苏醒，同时脑电图显示δ频段能量减少，提示了脑内多巴胺能系统参与了全身麻醉的苏醒过程。进一步的研究显示，静脉注射D1 受体激动剂也可以减短异氟醚麻醉后的苏醒时间并引起从持续异氟醚麻醉中的觉醒，且这一作用可被D1受体特异性的拮抗剂所逆转，但D2受体激动/拮抗剂则不影响异氟醚麻醉[15]。在乌拉坦麻醉中激活VTA引起的前额叶皮层由慢波睡眠到觉醒脑电，但前额叶皮层微注射D1受体拮抗剂SCH23390可以逆转激活VTA引起的皮层脑电改变[16]。这些与我们的结果相似，说明了D1受体可特异性地调控全身麻醉觉醒。

本研究也存在一些局限性。首先，在光纤钙信号记录中，当动物处于清醒或苏醒后状态时，由于动物自由活动以及样本量相对较小，获得的钙信号个体间差异较大。此外，vlPAG包含多种类型神经元，如GABA能神经元，谷氨酸能神经元以及多巴胺能神经元等，多巴胺受体在这些神经元上都有不同程度的表达，哪种神经元上的D1受体在丙泊酚全身麻醉中发挥着最重要的作用，仍需要将各类神经元进行分类探讨。

综上所述，腹外侧中脑导水管灰质神经元活性受到在丙泊酚麻醉的调控，而激活或抑制其神经元上表达的D1受体可对全身麻醉的诱导和苏醒过程产生调控作用。