引经药柴胡对姜黄素在大鼠体内组织分布的影响

李 娇 阮志国 李 江 付 鹏 李晓梅 荣慧莹 侯安国,2*

1.云南中医药大学,云南 昆明 650500；2.云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500

姜黄素(Curcumin，Cur)是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种天然多酚类化合物，具有广泛的药理活性、抗癌谱广且毒副作用小[1-2]，可诱导肝癌细胞凋亡，抑制其生长、增殖、转移和血管生长等[3]。柴胡始载于《神农本草经》，来源于[4]伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC)或狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld)的干燥根(本研究所用柴胡为前者)。其味苦，性微寒，归肝胆经，是公认的肝经引经药[5-6]。柴胡作为引经药使用在很多中药古方中可以见到，如《太平惠民合剂局方》中的逍遥散、《医方集解》中的龙胆泻肝汤，用柴胡舒利肝胆，并能引诸药归肝胆经[6]。现代中医临床在辨证论治的基础上选用引经药也取得了很大成效，郭利华应用不同中药引经药治疗肿瘤，效果良好[7]；石氏伤科在治疗骨伤疾患时非常注重引经药的应用，胸胁部使用肝经引经药柴胡、香附药对，上肢选用桂枝，下肢选用牛膝等[8]。

本研究以姜黄素为模型药物，将姜黄素与引经药柴胡合用，通过柴胡对姜黄素在大鼠体内分布的影响研究，验证引经药可“引药入病所”的靶向增效作用。同时将中医药引经理论与药物作用相结合，在此基础上应用现代药学理论来对柴胡的引经作用进行研究，为柴胡辅助肝靶向制剂给药提供新的思路。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；HSC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XK96-A快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司)；BT25S分析天平(赛多利斯仪器有限公司)。

1.2 药物与试剂 姜黄素对照品(纯度：98.7%，批号：110823-201706)，尼群地平对照品(纯度：99.4%，批号：100585-201705)均来自中国食品药品检定研究院；姜黄素(纯度≥98%，批号：DST181126—043，成都德思特生物技术有限公司)甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体重(220±20)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证：SCXK(湘)2016-0002。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse-C18(5 μm，4.6×250 mm)；柱温：40 ℃；流动相：1%冰乙酸∶乙腈(48∶52)；检测波长426 nm；流速1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 药液、对照品溶液的制备

2.2.1 药液制备 ①柴胡提取液的制备：用水加热回流提取(10倍水加热回流3次，每次30 min)，并分别调整药物浓度为每mL含生药0.05 g、0.1 g和0.2 g。

②姜黄素混悬液的制备：按大鼠体重称取姜黄素，加入适量纯净水，搅拌均匀即得。

③姜黄素与柴胡混合液的制备：按大鼠体重称取姜黄素，加入适量柴胡提取液，搅拌均匀即得。

2.2.2 姜黄素对照品储备液和内标溶液的制备 精密称取姜黄素对照品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1.004 mg/mL的姜黄素对照品储备溶液。精密称取内标尼群地平对照品于容量瓶中，加甲醇定容，制成含尼群地平对照品7.50 mg/mL的溶液，4 ℃密封保存备用。

2.3 样品处理方法

2.3.1 组织匀浆的制备 大鼠禁食12 h，自由饮水，在固定时间点处死大鼠，迅速取出肝、心、脾、肺、肾组织，用生理盐水洗净各组织表面的残血，滤纸吸干，精密称取各组织脏器1 g，剪碎，加入0.7 mL生理盐水进行组织匀浆，再加入适量生理盐水使其体积为3 mL。

2.3.2 组织样品的处理 精密吸组织匀浆液500 μL，精密加入内标溶液20 μL，混匀后加入乙腈3 mL，涡旋3 min，6000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL水浴(40±0.5)℃氮气流下吹干，加100 μL甲醇复溶，涡旋3 min，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别制备大鼠空白肝、心、脾、肺、肾组织空白匀浆液，含姜黄素对照品的各组织匀浆液，按照“2.3.2”项下方法处理按“2.1”项下条件进行检测。在上述色谱条件下，内源性杂质与姜黄素和内标分离良好，不干扰待测物的测定，表明该方法的专属性好。如图1所示。

2.4.2 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下姜黄素对照品储备液适量，加入到各空白组织匀浆液中，制成姜黄素质量浓度为0.100、0.502、1.004、5.020、10.040、15.060 μg/mL的质控样品，按“2.3.2”项下进行处理，记录色谱图，以姜黄素和内标的峰面积比值为纵坐标，姜黄素质量浓度为横坐标进行线性回归，作标准曲线(回归方程见表1)。以姜黄素峰信噪比为3时样品浓度为最低检测限，测得其最低检测限为0.100 μg/mL。

1-姜黄素 2-内标A.空白肝 B.空白肝加对照品 C.空白心 D.空白心加对照品 E.空白脾 F.空白脾加对照品 G.空白肺 H.空白肺加对照品 I.空白肾 J.空白肾加对照品图1 姜黄素HPLC图谱

表1 姜黄素的标准曲线方程

2.4.3 回收率试验 精密量取“2.2.2”项下姜黄素对照品储备液适量，加入到各空白组织匀浆液中，制成姜黄素低、中、高三个质量浓度(0.151、5.020、12.200 μg/mL)的质控样品，按“2.4”项下方法操作，进样，检测并记录姜黄素峰面积(As)与内标的峰面积(Ai)的比值W1，根据标准曲线方程计算样品的含量，将样品的实测质量浓度与理论质量浓度进行比较，计算方法回收率。另精密移取低、中、高3个浓度的姜黄素对照品溶液，加入20 μL内标，涡旋3 min混匀，水浴(40±0.5)℃氮气流下吹干后加100 μL甲醇复溶，涡旋3 min，0.22 μm微孔滤膜滤过进样测定，记录姜黄素峰面积(As)与内标的峰面积(Ai)的比值W2，W1/W2得萃取回收率。结果表明，姜黄素的方法回收率和萃取回收率的RSD均≤7.36%，符合生物样品定量分析的相关要求。见表2。

表2 姜黄素回收率试验结果 (n=5)

2.4.4 精密度试验 按“2.4.3”项下方法制备姜黄素低、中、高三个质量浓度(0.151、5.020、12.200 μg/mL)的质控样品，按照“2.3.2”和“2.1”项下试验，在同一天内不同时间测定5次，进行日内精密度考察，在相同条件下每隔1 d测定一次，连续测定3 d，进行日间精密度考察。结果显示，各组织匀浆的日内与日间精密度相关RSD均≤5.84 %，符合生物样品中方法学的要求。

2.4.5 稳定性试验 按“2.4.3”项下方法制备姜黄素低、中、高三个质量浓度(0.151、5.020、12.200 μg/mL)的质控样品，考察室温放置12 h，-20 ℃反复冻融3次，-80 ℃放置两周条件下样品的稳定性。在稳定性实验中不同条件下样品溶液中姜黄素含量的RSD均≤9.41 %，结果表明含姜黄素的血浆和组织样品在室温放置12 h，-20 ℃反复冻融3次，-80 ℃放置两周的条件下具有良好的稳定性。

2.5 组织分布学研究[9-10]

2.5.1 大鼠给药及取材 取雄性SD大鼠20只适应性喂养1周，随机分为4组，分别为姜黄素(500 mg/kg)单用组，以及姜黄素(500 mg/kg)分别与高、中、低剂量柴胡(0.51 mg/kg、1.02 mg/kg、2.04 mg/kg)合用组，每组5只，隔夜禁食不禁水，采用大鼠分别灌服姜黄素、姜黄素与柴胡混合液。给药后分别于0、5、15、30、45 min处死，迅速取出肝、心、脾、肺、肾，用生理盐水洗净各组织表面的残血，滤纸吸干，称重，同“2.3”项下处理，制备待测样品，按“2.1”项下进样测定分析。

2.5.2 药物组织分布图 姜黄素联合低剂量、中剂量柴胡组口服给药后，姜黄素在肝脏、脾脏中的分布都比较多，15 min时姜黄素联合低剂量组药物在肝脏中分布最多。姜黄素联合低剂量柴胡组大鼠姜黄素质量分数在肝脏中最高，其次是脾脏，在肺脏中最低。其大鼠肝脏、脾脏、肾脏组织中姜黄素质量浓度均高于另外三组。姜黄素给药后经体循环快速富集于肝脏和脾脏，而在其他组织中分布较少。如图2所示。

图2 组织分布图

2.5.3 靶向性评价[8,10-11]为了更好的评价引经药柴胡对姜黄素在大鼠体内组织分布的影响，引入以下参数：峰浓度比(Ce)、总靶向系数(Te)、药物分布效率(Rte)和相对摄取率(Re)。

Ce=(Cmax)m /(Cmax)s

Te=AUC(各个)/AUC(总和)

Rte=(Te)m/(Te)s

Re=(AUCi)m/(AUCi)s

注：m、s分别表示姜黄素与柴胡合用组和姜黄素单用组

其中，Te表示某组织药物占所测各脏器中总药量的百分比；两种制剂在某组织中的药物分布效率可用Rte表示，Rte>1，表示药物对组织脏器的选择性强，即靶向性强；Re表示在某一器官或组织内两种不同制剂的药物分布情况，Re>1表示在该器官或组织有靶向增强作用，越大增强效果越好，<1则表示无靶向增强作用。具体结果见表3。

从表3可以看出，姜黄素联合低、中剂量柴胡组与姜黄素单用组相比，姜黄素在肝、脾、肾组织药物浓度较高，其中在肝脏中药物浓度显著增加。此外，姜黄素联合低剂量柴胡组和姜黄素联合中剂量柴胡组姜黄素在大鼠肝脏和脾脏中AUC分别是姜黄素单用组的1.3、1.4、1.1、1.1倍。靶向性相关结果表明，当姜黄素和低剂量、中剂量的柴胡合用时，肝靶向作用明显，峰浓度比分别为1.94、1.47，相对摄取率分别为1.29、1.10，而与高剂量的柴胡合用时则无靶向性。同样，姜黄素与高、中、低剂量的柴胡合用都具有较强的脾脏引经作用。此外，姜黄素与中剂量的柴胡合用时，姜黄素在心脏、肺脏、肾脏的选择性比与低剂量的柴胡合用时的强。

表3 灌胃给予姜黄素和姜黄素联合柴胡后姜黄素在大鼠组织中的靶向性

3 讨论

低剂量的柴胡与姜黄素合用可增加姜黄素在肝脏、脾脏的分布，中剂量的柴胡与姜黄素合用可增加姜黄素在肝脏、心脏、脾脏、肾脏的分布，而高剂量的柴胡与姜黄素合用后除了脾脏，其它脏器的药物分布均减少。以峰浓度比、总靶向系数、药物分布为评价指标，低剂量柴胡组肝靶向效果最好，表明柴胡的肝靶向性与其剂量存在一定的关联性。

引经药的应用是中医方剂配伍的一大特色，其作用是使药物有效成分靶向集中于特定的部位，从而提高疗效，其应用在临床上颇具意义[12-16]。本研究中，姜黄素配伍引经药柴胡后，大鼠的肝、心、脾、肺、肾组织药物浓度均有一定的增加。其中在肝脏中药物浓度显著增加，说明了柴胡的引经作用与其改变药物体内分布直接相关。本研究将中医药引经理论与药代动力学研究方法结合，探讨了引经药柴胡对姜黄素在大鼠体内分布的影响，结果表明，柴胡对姜黄素在大鼠体内具有引药入肝经的作用。同时本研究也为柴胡引经的有效性提供了依据，同时为柴胡辅助肝靶向制剂给药提供新的思路。