藏药猪毛蒿精油质量标准研究

祝清灿

国药集团同济(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550026

猪毛蒿为菊科植物猪毛蒿ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.的地上部分，经水蒸气蒸馏法提取得猪毛蒿精油。猪毛蒿精油为浅黄色至棕黄色澄清液体，有特异香气，味微辛，据文献[1-4]报道，对真菌有很强的抑制作用，藏族地区民间常用于治疗手、足癣等皮肤病，是藏药妇洁搽剂[5]的主要成分之一。猪毛蒿精油化学成分以单萜为主(80.74%)，主要成分有丁香酚、桉叶素、柠檬烯、β-丁香烯、α-蒎烯、β-蒎烯等[6-8]。丁香酚是猪毛蒿精油中的主要成分，具有麻醉、抗菌防腐、杀虫、解热、降温、抗性氧化、抗衰老等药理作用[9]。Pinto等[10]研究发现丁香酚不仅对皮肤癣菌属和曲霉菌属具有抗菌活性，而且对氟康唑有天然耐药的克柔念株菌和易诱导耐药的光滑念珠菌均表现出较高的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌等12种细菌具有较好的抗菌作用[11-12]。

丁香酚存在于猪毛蒿精油中，是一种极具开发潜力的活性成分。为了控制猪毛蒿精油产品质量，确保临床疗效，本实验采用薄层色谱法进行猪毛蒿精油鉴别，采用气相色谱法(GC—MS联用)对猪毛蒿精油中的丁香酚进行含量测定，为制定质量标准提供科学依据。

1 材料与仪器

安捷伦6890A-5973气质联用仪，AB104-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，ZF-I三用紫外分析仪，YOKO-ZS薄层色谱成像仪(武汉药科新技术开发有限公司生产)。

丁香酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110725-201414)，猪毛蒿精油对照提取物(中国食品药品检定研究院，批号：610007-201501)，猪毛蒿由青海省食品药品检验所杨凤梅主任鉴定，化学试剂为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)，硅胶G预制板(德国默克公司生产，批号HX242369)。

猪毛蒿精油样品(批号为20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106)，由青海普兰特药业有限公司生产。

2 试验方法与结果

2.1 鉴别 取本品100 mg，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取猪毛蒿油对照提取物，同法制成对照提取物溶液。再取丁香酚对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含5 μL的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[13]试验，吸取上述两种溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照提取物和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点(A)。置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照提取物和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点(B)。结果如图1所示。

A 日光下检视1～5.样品 6.猪毛蒿精油对照提取物 7.丁香酚对照品 8～12.样品

2.2 丁香酚含量的GC法测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：TR-5毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm，膜厚0.25 μm)；载气为高纯氮气，纯度>99.999%。流速1.5 mL·min-1；柱温为程序升温：初始温度为80 ℃，以每分钟5 ℃的速率升温至140 ℃，再以每分钟50 ℃的速率升温至220 ℃，保持3 min；进样口温度为220 ℃；检测器为240 ℃；分流进样，分流比为10∶1。理论板数按丁香酚峰计算应不低于10000。如图2所示。

A.丁香酚对照品 B.猪毛蒿精油供试品 C.溶剂图2 猪毛蒿精油及丁香酚GC图

在上述条件下，在图2-A中，对照品丁香酚的峰出现在tR8.99,在图2-B中，出现与对照品丁香酚保留时间相似的峰tR8.99，应为样品中的丁香酚，且与样品中其他组分色谱峰达到基线分离。

2.2.2 对照品溶液制备 取丁香酚对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为测定用对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取本品约0.1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 专属性试验 对猪毛蒿油供试品溶液进行气质联用分析，具体参数如下：色谱柱：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气为高纯氦气，纯度>99.999%。流速1.2 mL·min-1；柱温为程序升温：初始温度为80 ℃，以每分钟10 ℃的速率升温至240 ℃，保持4 min；进样口温度为250 ℃；检测器为260 ℃；分流进样，分流比为10∶1。电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；连接线温度：280 ℃；四级杆温度：150 ℃。结果：分子离子峰的质荷比为164.1，保留时间(9.96)与丁香酚峰相似，其裂解与丁香酚相同，猪毛蒿精油供试品中丁香酚峰质谱图与标准谱库(安捷伦Chemstation色谱工作站NIST MS Search 2.0标准谱库)中丁香酚的质谱图匹配度为98%，其特征离子为77、103、149和164(其中164为定量离子)，且对应质谱碎片离子的质荷比与标准一致，其丰度比偏差在规定范围内，因此可认为是同一物质。如图3、图4所示。

图3 猪毛蒿精油供试品中丁香酚峰的 MS图

图4 丁香酚对照品标准质谱图

2.2.5 标准曲线制备 精密称取丁香酚对照品0.04656g(含量按100.0%计算)，置50mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，浓度为931.2 μg·mL-1。精密吸取对照品储备液，用乙酸乙酯稀释配制成系列浓度标准溶液，浓度分别为：46.56、93.12、186.2、232.8、465.6 μg·mL-1。分别精密吸取系列浓度标准溶液1.0 μL，注入气相色谱仪，按照“2.2.1色谱条件”测定。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性回归方程为：Y= 12599767.5X-23282.6(r=0.99999)。结果表明：丁香酚进样量在0.04656～0.4656 μg范围内与峰面积值具有良好的线性关系。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号20180906)，分别于0、1、2、4、10 h测定其峰面积，按上述色谱条件测定，结果供试品丁香酚峰面积的RSD=1.7%。表明制备的供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批样品(批号20180906)精密称取0.1 g,各6份，按2.2.3项下的方法制备供试品溶液，进行含量测定，结果丁香酚含量的平均值为：52.52 mg·g-1，RSD为1.6%，说明试验方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收试验 精密称取丁香酚对照品0.04656g(含量按100.0%计算)，置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，备用(含丁香酚0.9312 mg·mL-1)。

取同一批号样品(批号20180906，含丁香酚为52.52 mg·g-1)各6份，每份约0.05 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入回收对照溶液3 mL，按含量测定的方法制备回收用供试品溶液并测定含量，计算丁香酚的平均回收率为101.2%。结果见表1。

表1 丁香酚加样回收试验测定结果

2.2.9 样品的测定 取20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106共10批样品，照上述含量测定方法测定丁香酚含量，结果分别为：60、71、52、63、81、62、65、76、87、48mg·g-1。平均值为66.5mg·g-1，最低值为48mg·g-1。

经过上述方法学验证和耐用性试验考察，结果表明：本实验的色谱条件对丁香酚的定量测定专属性高、重现性好、分离能力强、灵敏度高、操作简便。

3 讨论

3.1 薄层色谱法供试品制备 比较了供试品乙酸乙酯、丙酮和三氯甲烷溶解，以乙酸乙酯为溶剂制备供试品溶液分离度较好，斑点清晰。

3.2 薄层色谱条件选择 曾采用环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)、石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)、苯-丙酮(19∶1)等展开剂进行分离，结果表明以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)分离效果最好，特征斑点清晰。

3.3 丁香酚含量测定研究 采用GC—MS联用技术，比仅采用气相色谱法测定含量提高了可靠性和准确性。分别比较了正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚(30～60 ℃)为提取溶剂的丁香酚含量结果，结果表明：以乙酸乙酯作为供试液溶剂，样品中丁香酚溶解完全，测得含量较高，故最终选用乙酸乙酯为溶剂。

3.4 气相色谱法耐用性考察 采用不同的进样口温度(210 ℃、220 ℃、230 ℃)、不同的检测器温度(230 ℃、240 ℃、250 ℃)和不同的柱温(70 ℃、80 ℃、90 ℃)及不同品牌和长度的色谱柱(TR-5，30 m×0.32 mm，0.25 μm和HP-5，25 m×0.32 mm，0.17 μm)进行耐用性试验考察。结果表明，在不同的进样口温度、不同的检测器温度、不同的柱温及不同品牌的色谱柱的小范围变动情况下具有耐用性，均可准确检出丁香酚。

猪毛蒿精油中有较高含量的抑菌有效成分丁香酚，广泛应用于临床及工业化中药制剂的生产，因此，建立猪毛蒿精油的质量标准，有效控制精油质量显得尤为重要，笔者的研究结果为制定其质量标准提供了科学依据。