新疆阿克苏地区结核分枝杆菌的基因分型与耐药性分析

刘丙雨，贾鹏霞，李新月，张万江，程 江，吴江东，马雅静，2

(1.石河子大学新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832000；2.石河子大学医学院第一附属医院检验科，新疆 石河子 832000)

结核病是由结核分枝杆菌感染人体导致的一种慢性传染性疾病。根据WHO报告显示，2018年世界新发结核病例约有1 000万例，我国是全球30个高负担国家之一[1]。新疆一直是全国结核病高发地区，呈现出高感染、高发病、农村高疫情、年递减率低的“三高一低”特点[2-3]。王希江等对全疆96个县市进行时空聚集性扫描，发现阿克苏地区、喀什地区、和田地区等地区聚集性分布最强[4]。本研究以MIRU-VNTR为基础，采用Luo等建立的12位点基因分型方法[5]，对阿克苏市及周边8县地区的痰涂片阳性的结核病患者分离培养得到的结核杆菌进行基因分型，并采用比例法对一线抗结核药进行药物敏感试验，了解该地区结核菌株基因分型和耐药性及主要传播方式，为结核病预防及治疗提供导向。

1 资料与方法

1.1菌株来源：收集2018年9月～2019年10月新疆阿克苏地区第二人民医院痰涂片阳性的维吾尔族结核病患者经临床分离培养得到的结核杆菌186株，结核杆菌标准株H37RV购自国家结核病参比实验室。所有菌株-80℃保存。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2主要方法

1.2.1药敏试验：按照《结核病实验室检验规程》[6]进行药物敏感试验。采用比例法进行药物敏感试验，终浓度分别异烟肼0.2 μg/ml、利福平40.0 μg/ml、乙胺丁醇2.0 μg/ml、链霉素4.0 μg/ml。耐药百分比=(含药培养基的菌落数/阴性对照培养基的菌落数)×100%。耐药百分比>1%，表示对该药耐药；≤1%，表示敏感。

1.2.2结核杆菌DNA提取：用接种环从罗氏培养基中挑2满环结核分枝杆菌，置于含200 μl生理盐水的EP管中，金属浴100℃,60 min后取出，置于冰上5 min，13 000×g,离心15 min，取上清液于1.5 mlEP管中，-20℃保存备用。

1.2.3基因分型：采用Luo提出的符合我国国情的12位点分型方法[5]，分别是QUB11b、QUB18、QUB26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR2372、VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232。采用RD105缺失基因检测北京型与非北京型，使用北京康为世纪公司生产的TB基因分型试剂盒，PCR反应体系和反应条件及结果判读参照说明书。

相关定义如下:①簇：不同菌株基因型相同数≥8个定义为一簇，表示可能与近期传播有关联；独特基因型为单一基因型，表示该病例可能是内源性复燃而得病[8]。②耐药结核杆菌：患者体内感染的结核杆菌对任意一种抗结核药物产生耐药。耐多药结核杆菌：结核患者感染的结核分枝杆菌至少同时对异烟肼和利福平产生的耐药。

1.3统计学分析：应用SPSS17.0软件进行数据整理及统计学分析，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法；以是否成簇为因变量，成簇定义为1，非成簇定义为0，患者信息为自变量，采用多因素Logistic回归分析，Bio Numerics7.0软件进行聚类分析。所有检验都为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1药敏试验结果：186株结核杆菌总耐药率为34.9%(65/186)，耐多药率28%(52/186)。初治患者耐药率明显低于复治患者耐药率，初治患者耐多药率明显低于复治患者耐多药率，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 药敏试验结果比较[例(%)]

2.2基因分型与耐药性相关分析

2.2.1北京型与非北京基因型：北京基因型和非北京基因型在耐药性方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 基因分型与耐药结果相关分析[例(%)]

2.2.2基因多态性及分型结果比较：采用12位点基因分型方法，分析不同位点基因多态性(HGDI)，总分辨率0.998，其中VNTR3820位点分辨率最高(0.913)，MIRU40位点分辨率最低(0.587)。186株分型结果及聚类分析树状图见图1所示。共产生156种基因型，其中独特基因型129种，余成27簇，每簇2～3株，共57株，成簇率16.1%。

图1 结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因分型聚类分析树状图

2.2.3菌株成簇(近期传播)的影响因素分析：经单因素分析发现菌株成簇在年龄、职业、治疗史、耐药、耐多药等方面的差异有统计学意义，在性别、吸烟史、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、营养不良史、文化程度、家庭年收入等方面差异无明显统计学意义。将菌株分型结果是否成簇当作因变量，成簇是1，非成簇是2。将年龄、职业、治疗史、耐药、耐多药等可能的危险因素作为自变量纳入多因素Logistic回归模型，使用ENTER法分析。结果显示耐多药(OR=12.328，95%CI:5.235～16.875)和治疗史(OR=5.718,95%CI:2.914～11.217)是影响患者成簇的独立危险因素，相比敏感菌株，耐多药和复治患者更容易成簇即耐多药和复治是近期传播的危险因素。见表3。

表3 肺结核患者基因分型与病人临床资料的影响因素分析[例(%)]

3 讨论

不同地区结核杆菌基因分型及表型耐药状况有所不同[9]。本研究发现阿克苏地区菌株成簇率16.1%，成簇提示患者近期可能被同一传染源感染，说明近期传播在该地区结核病的流行中占有一定比例。

结核杆菌在不同省份的分子流行病学研究显示北京基因型占主导地位，但是否与耐药性相关尚不明确；阿克苏地区也以北京基因型为主，二者于耐药性上差异无统计学意义(P>0.05)，表明该地区北京型与耐药性无明显相关性。此研究结果与北疆地区[10]、北京地区[11]、陕西地区[12]等研究结果一致；不同地区结核杆菌的耐药性呈现多样性，药敏实验显示本地区总耐药率34.9%，低于北疆地区[11](40.35%)，基本和邢台地区[13](31.6%)一致。

耐药是目前治疗结核病的一大棘手问题，结合本文研究结果得出耐药菌株有可能较非耐药菌株倾向于近期传播；分析基因型与病例相关资料发现，在阿克苏结核病患者中，男女比例1.19∶1，与HortonKC等调查结果[14]相符。年龄以60岁以上为主，职业以农民为主，与郝艳艳[15]、王希江[4]、王玥[16]等研究结果一致。影响结核杆菌成簇的危险因素，不同地区研究结果略有差异[9,17]。本研究得出复治和耐多药是影响结核杆菌成簇的独立危险因素，因此，加强复治患者健康教育的同时，注重强调服药督导的重要性，在加强本地区结核病的耐药筛查的同时，注重MDR-TB患者的早发现、早诊断、早治疗，从而最大限度减少耐多药结核杆菌的产生和传播。新疆一直是我国结核病高发地区，阿克苏及周边地区是新疆结核病高发的时空聚集地区之一，从分子流行病学角度了解本地区结核杆菌成簇情况及影响因素，为结核病的防控提供更多有价值的信息。