mNGS在中枢神经系统感染中的诊断效能评估

李 霞，谭少华，韩 孟，叶明欣，李少梅

(广州市番禺区中心医院，广东 广州 511400)

中枢神经系统感染性疾病是一种常见的神经系统感染性的急危重症，具有潜在的致死性，并且在世界范围内具有较高的发病率和死亡率。其致病微生物众多，包括细菌、病毒和真菌以及寄生虫等，疾病的临床表现往往呈现非特异性，如果不能及时识别其致病病原体并给予针对性的治疗，则会导致患者的病情迅速发展为持续高热、癫痫、昏迷甚至死亡。因此，在中枢神经系统感染性疾病的诊治过程中，病原体的明确起着至关重要的作用[1]。迄今为止，对中枢神经系统感染的诊断依然面临着很大的挑战，其临床症状多种多样，且感染症状与非感染症状常常发生重叠，给准确诊断造成了很大困难。在既往的临床诊治过程中，临床医生只能通过脑脊液常规、生化、培养等结果判定患者可疑的病原体种类，2013年，美国C.Y.Chiu教授首次应用mNGS技术诊断了14岁小男孩的钩端螺旋体脑病并挽救了他的生命，引起了全球神经科医生对mNGS技术在病原体检测方面应用的巨大兴趣，并进行了探索性研究[2]。近年来，既往的研究宏基因组测序在神经系统感染中的应用多以个案报道为主，依然不能评估mNGS在神经系统感染中的诊断价值。本研究对疑似中枢神经系统感染分别行脑脊液mNGS检测和常规培养检测，并对相关结果进行对比分析，以明确mNGS可以为临床神经科感染性疾病的精准治疗提供可靠的工具，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2019年1月～2019年12月就诊于我院的疑似中枢神经系统感染的39例患者为研究对象，男21例，女18例，年龄15～88岁，平均(39.9±5.7)岁。所有患者均签署了知情同意书。根据2016年《细菌性脑膜炎诊治指南》[3]，纳入发热、头痛、癫痫、精神状态改变、记忆力下降，脑膜刺激征阳性，或影像学提示脑炎脑膜炎的可能的患者。

1.2方法：观察组行mNGS检测：进行样本采集与mNGS检测，每名患者采集约2～3 ml脑脊液样本，并进行无菌密封，于-20℃储存或干冰冷链物流运输至予果生物科技有限公司(中国,北京)，按照DNA提取、文库构建，在Illumina平台上运行宏基因组二代测序，然后进行数据分析。首先运用通过过滤掉原始数据中低质量序列和短序列(长度<50 bp)得到高质量测序数据，再运用SNAP软件去除人类基因，最后通过Burrows-Wheeler同时与微生物基因组数据库进行比对，从而对序列分类，数据库来源于NCBI，包括超过20 000种微生物，覆盖了与人类疾病相关的11 910种细菌、7 103种病毒、1 046种真菌和305种寄生虫的基因组。

对照组行常规培养检测：采集约4～6 ml脑脊液样本，将其接种在厌氧菌、需氧菌培养基中进行培养，控制二氧化碳浓度在6%～11%，温度控制在35～36℃，18～24 h后进行观察，分析是否有增菌液浑浊现象或菌膜组织，提取培养液或菌膜，接种在血平板中，进行病原体的分离培养，然后开展离心处理工作，涂片干燥之后，进行革兰染色镜检检验。

1.3观察指标：①诊断符合率：患者以患者急性起病，以头痛、发热、昏迷、抽搐、精神行为异常等为主要临床表现，查体提示脑膜刺激征阳性，脑脊液压力正常或升高，脑脊液白细胞计数升高，临床抗感染治疗后有效，考虑诊断中枢神经系统感染明确。统计观察组mNGS阳性、阴性与临床诊断相符合例数，对照组常规脑脊液培养阳性、阴性与临床诊断相符合例数。②统计观察组mNGS组和对照组常规脑脊液培养组灵敏度、特异度、一致性。

1.4统计学处理：所有数据均由SPSS 18.0软件处理，计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验及Fisher's 检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组诊断符合率比较：39例患者中，观察组mNGS阳性、阴性与临床诊断相符合总例数29例，对照组常规脑脊液阳性、阴性与临床诊断相符合总例数13例，观察组诊断符合率明显高于对照组，差异有统计学意义(χ2=11.61，P<0.001)。

2.2两组灵敏度、特异度、一致性：mNGS组有16例患者mNGS结果为阳性，灵敏度为61.54%，特异度100%，一致性为74.36%。常规脑脊液培养所有39例疑似病例均为阴性结果；常规脑脊液培养的灵敏度为0，特异度100%，一致性为33.3%。观察组灵敏度、特异度、一致性均明显高于对照组，见表1。

表1 两组灵敏度、特异度、一致性比较(%)

3 讨论

对入组的疑似中枢神经系统感染的患者的脑脊液进行宏基因组检测，以对mNGS在中枢神经系统感染的诊断效能进行评估。

既往对病原体的诊断较多的依靠脑脊液的常规、生化、培养、镜检，近年来还有基于PCR的病原特异性核酸检测。但脑脊液的培养、镜检的阳性率比较低，无法早期或者超早期给与临床指导，脑脊液的常规、生化经常会受到患者的病程或者抗生素的应用而产生非特异性的表现[4]。所以在临床诊治过程中，临床医生基本要综合患者的临床特点、脑脊液常规、生化结果进行可能性的诊断，比如划分为病毒性、细菌性、真菌性等，无法得到明确的病原体诊断，而对于少见的、罕见的病原微生物，更是无法精准性的识别。

高通量测序技术又称二代测序技术，具有检测速度快、准确率高、覆盖面广等特点，能很好地直接从临床样本(血液、脑脊液、肺泡灌洗液等)中识别罕见、新颖、难以检测和共感染的病原体[5]，近年来研究者应用mNGS技术陆续对人类疱疹病毒、伪狂犬病毒、囊虫、弓形虫等感染提供了的诊断依据[6-7]，并指导治疗有效。在临床研究中，mNGS技术提供了脑脓肿患者嗜血杆菌、脑炎患者的猪链球菌、水痘带状疱疹病毒、人类疱疹病毒6B、人类(伽马)疱疹病毒第四型等病原体的精准证据。

本研究中mNGS阳性共16例，灵敏度61.74%，特异度为100%。国外有研究也发现NGS有诊断特异度高、灵敏度低的特点，与本研究结果[8]一致。为综合考虑灵敏度和特异度，我们使用ROC曲线对mNGS诊断能力进行判断，ROC曲线下面积(AUC)为0.81，说明mNGS在中枢神经系统感染性疾病的诊断能力较强。同脑脊液培养相比，我们使用综合判别改善指数(IDI)来进行说明，IDI是指新模型(NGS)和旧模型(脑脊液培养)对于每个个体预测中枢神经系统感染发生概率之差，结果发现IDI=0.35>0，说明mNGS预测感染性疾病的概率高于脑脊液培养，mNGS更准确。本次研究定量的反映了mNGS的诊断能力，并与传统脑脊液培养的诊断手段进行了比较，用数据证明了mNGS为临床中枢神经系统感染性疾病更好的诊断手段。

但是，并非所有的患者均能得到阳性结果，本研究中分析原因可能为：①采样环节造成的假阴性，如病原载量过低，采集到的病原低于检测限，或者未取到感染部位的样本；②储存或运输过程造成的假阴性，如未严格-20℃低温冻存导致核酸降解；③实验环节造成的假阴性，如真菌破壁效率较低，影响真菌检出率；④数据库不完善造成的假阴性，如新发病原体未包含在数据库中，从而无法检测出新发病原体；⑤mNGS方法学原理造成的假阴性，如人源序列比例过高，导致病原体测序序列数过低。同时我们还需要避免采样环节如腰椎穿刺过程、标本转移过程的污染，实验环节、测序环节的污染如实验试剂、耗材、气溶胶的污染、测序错误等。所以，得到mNGS数据后，我们还要综合患者的临床特点、脑脊液特性、测序序列数的情况进行综合分析，从而得到可靠的诊断结果，进行精准治疗，改善患者预后。另外随着技术进步，如果更有效的工作流程，更低的检测成本、快速周转时间，以及简化精确的解释标准，mNGS将在临床实践中被广泛接受。

综上所述，相对于阳性率较低的病原微生物培养技术，mNGS技术通过分析样本的病原微生物的序列信息，判断出微生物的物种，具有高效、快速、精准的优势，为我们临床感染性疾病的诊治提供有力的依据，对改善患者的临床预后具有积极意义。