热毒宁联合甘草酸苷治疗Ⅱ期手足口病及其免疫相关指标的改变

黄胜贤，郑利平，罗杰平，陈丽珍，黄盼柳，甘振钊，杨 兰

(广西医科大学第三附属医院暨南宁市第二人民医院，广西 南宁 530031)

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是肠道病毒引起的发热、手足口臀部位疱疹的急性传染病，主要由肠道病毒71型(EV71)、A 组柯萨奇病毒(Cox A)和埃可(Echo)病毒引起。大部分HFMD患儿可自限，预后良好，而部分患儿却病情严重，继发严重后遗症甚至危及生命[1]。导致HFMD 转归悬殊的因素不仅与患儿所感染的病毒类别、患儿免疫功能相关，而且与及时有效的治疗密切相关。因此，本研究旨在探讨具有免疫调节作用的热毒宁及甘草酸苷联合干预下，Ⅱ期HFMD患儿的治疗成效及免疫功能的变化，以期为临床研究HFMD的药物治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1研究对象：将2017年1月～2019年10月在南宁市第二人民医院诊疗的286例Ⅱ期HFMD患儿随机分为四组，其中，热毒宁组：男39例，女34例，年龄7～76个月，平均年龄36.9个月；甘草酸苷组：男39例，女33例，年龄6～81个月，平均年龄34.3个月；联合用药组：男42例，女33例，年龄6～84个月，平均年龄35.7个月；常规用药组：男37例，女29例，年龄5～77个月，平均年龄34.4个月。同时选取在医院体检中心进行健康体检的健康儿童 63例作为对照组，男35例，女28例，年龄10～81个月，平均年龄38.3个月。5组研究对象在年龄和性别上差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

Ⅱ期HFMD患儿纳入标准：①参照《肠道病毒 71 型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识(2011 版)》[2]明确诊断的Ⅱ期HFMD患儿；②出现发热，患儿的手、足、臀有疱疹、斑丘疹，周围有炎性红晕，同时伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状；③口腔溃疡较手、足、臀部疱疹出现时间早；④血常规检测白细胞正常或略有升高；⑤征得患儿监护人同意，并签署知情同意书。排除标准：①药物过敏；②合并有其他心、肺、脑等疾病；③有严重细菌感染；④合并感染湿疹、水痘或口蹄疫等疾病；⑤伴有严重营养不良、血液病者；⑥依从性差或者中途退出研究者。本研究经我医院医学伦理委员会批准通过。

1.2治疗方案：常规用药组进行常规方法治疗，包括退热，口腔疼痛局部对症治疗，抗病毒治疗，维持水电解质及酸碱平衡；热毒宁组在常规用药组基础上给予热毒宁输注。按照0.6～0.8 ml/kg输注热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司)，1次/d，连用5 d；甘草酸苷组常规用药组基础上给予甘草酸苷治疗：口服复方甘草酸苷片(中国卫材药业有限公司)50 mg/次，1次/d，连用5 d；联合用药组在甘草酸苷组的基础上给予热毒宁治疗，1次/d，连用5 d。

1.3实验室检测

1.3.1标本采集：抽取治疗5 d后的空腹静脉血约5 ml，分别注入干燥管和 EDTA-K2抗凝管中。干燥管静置30 min后，以转速3 000 r/min离心10 min，分离血清用于测定免疫球蛋白 lgG、IgM、IgA水平。EDTA-K2抗凝管充分混匀，用于T淋巴细胞、Th 细胞、Tc 细胞、NK 细胞和 B 淋巴细胞百分比的测定。

1.3.2主要仪器和试剂：BD FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD公司)，特定蛋白分析仪(德国西门子公司)，lgG、IgM、IgA试剂(德国西门子公司)；T 淋巴细胞、Th 细胞、Tc 细胞、NK 细胞和 B 淋巴细胞流式细胞检测试剂(美国BD公司)。

1.3.3免疫球蛋白lgG、IgM、IgA的检测：按照特定蛋白分析仪及相关试剂盒说明书检测研究对象外周血清中免疫球蛋白lgG、IgM、IgA的水平。

1.3.4T淋巴细胞、Th 细胞、Tc 细胞、NK 细胞和B淋巴细胞百分比的测定：按照流式细胞仪及相关试剂盒说明书检测所有研究对象 T 淋巴细胞(CD3+)、Th 细胞(CD3+CD4+)、Tc 细胞(CD3+CD8+)、NK 细胞(CD16+CD56+)和 B 淋巴细胞(CD19+)在外周血中的数量及其所占淋巴细胞的百分比。

1.4观察指标及评判标准：(1)临床疗效观察:①退热时间：包括退热起效时间(HFMD患儿治疗后，肛温下降0.5 ℃所需时间)及恢复正常体温时间(治疗后HFMD患儿肛温≤37.5 ℃，且持续24 h以上)。②皮疹消失时间：无新皮疹出现，且原有皮疹结痂或脱落所需时间。③危重转化率情况；从Ⅱ期转为危重型的HFMD患儿比例。④精神状态恢复情况、惊颤消失时间。(2)疗效标准：连续用药5 d后观察治疗效果。治愈：体温正常，皮疹消退，精神好，无惊颤等精神受累症状；有效：体温正常，皮疹减少，精神好转，惊颤次数减少；无效：反复发热，皮疹无变化，频繁惊颤，意识障碍加重等。总有效率=(治愈+有效)÷总例数×100%。

2 结果

2.1Ⅱ期HFMD患儿临床疗效观察指标比较：4组Ⅱ期HFMD患儿的退热起效时间、体温恢复正常时间、皮疹消失时间、精神状态恢复或惊颤消失时间及临床疗效差异有统计学意义(P<0.05)。进一步组间比较，热毒宁组、甘草酸苷组和联合用药组的上述指标较常规用药组有显著差异，差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药组的危重转化率较常规用药组差异有统计学意义(χ2=5.640，P=0.018)。热毒宁组、甘草酸苷组和联合用药组两两比较，体温恢复正常时间、皮疹消失时间、精神状态恢复或惊颤消失时间有明显差异，差异有统计学意义(P<0.05)，加重转化率及疗效观察略有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)。甘草酸苷组的退热起效时间虽略高于热毒宁组，但差异无统计学意义(P=0.094)。见表1、表2。

表1 Ⅱ期HFMD患儿临床观察指标比较

表2 Ⅱ期HFMD患儿临床疗效比较[例(%)]

2.2Ⅱ期HFMD组与对照组的免疫细胞及免疫球蛋白的结果比较：较对照组，Ⅱ期HFMD患儿组的T 淋巴细胞(CD3+)及Th 细胞(CD3+CD4+)的百分比、Th 细胞/Tc 细胞比值和 免疫球蛋白的lgG、IgA水平显著降低，B淋巴细胞百分比和IgM明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。Tc细胞百分比较对照组略降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 Ⅱ期HFMD患儿与对照组的免疫细胞及免疫球蛋白的结果

2.3Ⅱ期HFMD患儿外周血中T 淋巴细胞(CD3+)、Th 细胞(CD3+CD4+)、Tc 细胞(CD3+CD8+)、NK 细胞(CD16+CD56+)和 B 淋巴细胞(CD19+)的检测结果：Ⅱ期HFMD患儿4组间的外周血T 淋巴细胞(CD3+)、Th 细胞(CD3+CD4+)、Th 细胞/Tc 细胞比值 和 B 淋巴细胞(CD19+)的百分比差异有统计学意义(P<0.05)。进一步组间比较，热毒宁组、甘草酸苷组和联合用药组的T 淋巴细胞(CD3+)、Th 细胞(CD3+CD4+)、Th 细胞/Tc 细胞比值 和 B 淋巴细胞的百分比较常规用药组有显著差异，差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药组的Th 细胞百分比、Th 细胞/Tc 细胞比值，高于热毒宁组，差异有统计学意义(P=0.027；P=0.019)，虽略高于甘草酸苷组，但差异无统计学意义(P=0.094；P=0.073)。热毒宁组的B淋巴细胞百分比明显高于甘草酸苷组和联合用药组，差异有统计学意义(P=0.024；P=0.013)，见表4。

表4 Ⅱ期HFMD患儿免疫细胞测定结果

2.4Ⅱ期HFMD患儿外周血中免疫球蛋白lgG、IgM、IgA的检测结果：Ⅱ期HFMD患儿4组间的外周血免疫球蛋白lgG、IgM、IgA水平差异有统计学意义(P<0.05)。组间进一步比较，热毒宁组、甘草酸苷组和联合用药组的免疫球蛋白lgG、IgM、IgA较常规用药组有显著差异，差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药组的lgG、IgA水平高于热毒宁组，差异有统计学意义(P=0.027；P=0.019)，免疫球蛋白 IgM 水平较热毒宁组稍有升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关性分析结果显示，血清中IgM水平与外周血中B淋巴细胞百分比呈正相关(r=0.841,P=0.018)。

图1 免疫细胞分析结果图

表5 Ⅱ期HFMD患儿四组外周血中免疫球蛋白的检测结果

3 讨论

目前，HFMD治疗尚无特效药，Ⅱ期及以上重症患儿的治疗，主要在身体各脏器全面检查的基础上实施综合性的药物对症治疗。有研究表明重症HFMD的发生与病毒的直接损伤和免疫紊乱导致机体损伤密切相关[3-4]。因此抗病毒及纠正免疫功能紊乱是治疗重型HFMD的主要措施。热毒宁是由金银花、青蒿和栀子提取精制而成的中药注射液，具有清热、解毒、疏风功效。有研究提示热毒宁具有退热、抗病毒、抗感染及提高免疫力的作用[5]，体外药理研究也证实热毒宁能够对抗Cox A及 EV71型病毒[6]。甘草酸苷是甘草的主要活性成分，具有抗感染、抗病毒、免疫调节等多种药理作用。尹翠红等研究表明消化道内的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶可将甘草酸苷水解为18β-甘草次酸和葡萄糖醛酸[7]。具有类皮质醇样结构的18β-甘草次酸，可通过抑制11β-羟基固醇脱氢酶的活性发挥皮质醇的作用[8-9]。热毒宁注射液临床使用常与抗菌药物、抗病毒药物、糖皮质激素肾上腺素、注射用盐酸氨溴索等联用，可提高疗效、缩短病程。因此，本研究欲探讨热毒宁与具有类皮质醇作用的甘草酸苷联用对Ⅱ期HFMD患儿的免疫功能的影响及疗效。

本研究结果显示，较常规用药组，热毒宁、甘草酸苷治疗的Ⅱ期HFMD患儿热退时间、皮疹消退时间、精神状态恢复或惊颤消失时间明显缩短，提示热毒宁、甘草酸苷疗效优于常规用药组，而热毒宁联合甘草酸苷较单用热毒宁、甘草酸苷的热退时间、皮疹消退时间、精神状态恢复或惊颤消失时间显著下降，说明热毒宁联用甘草酸苷在治疗Ⅱ期HFMD有显著的疗效。热毒宁联合甘草酸苷治疗患儿危重型转化率明显低于常规用药组，体现了热毒宁联用甘草酸苷可降低危重症转化率。较正常健康儿童，Ⅱ期HFMD患儿的免疫细胞T 淋巴细胞、Th 细胞百分比及Th 细胞/Tc 细胞比值明显降低，B 淋巴细胞百分比显著升高。这与王洁等认为感染EV71病毒后机体淋巴细胞将处于低水平状态，B淋巴细胞处于活化增殖状态的结论一致[10]。机体感染EV71后通过多种途径引起 T 细胞凋亡或抑制其增殖，从而引起细胞免疫和固有免疫紊乱。当细胞免疫功能低下不能有效杀灭或抑制病毒时，机体会通过活化 B 细胞、成浆细胞分泌大量抗体，积极调动体液免疫来参与抗病毒过程[10]。但Ⅱ期HFMD患儿IgA、IgG 水平较健康儿童明显降低，IgM 水平升高，分析原因可能是EV71病毒感染后，增加了免疫球蛋白的消耗，同时早期体液免疫应答反应产生大量IgM，导致免疫球蛋白间趋势不一致的情况。本研究中 Ⅱ期HFMD患儿 NK 细胞较正常儿童低，这与其他报道中 NK 细胞偏低结论一致[11-12]，HFMD患儿重症化后NK细胞可能耗竭或功能障碍状态,导致NK细胞水平偏低。单独或联合使用热毒宁、甘草酸苷的Ⅱ期HFMD患儿的T 淋巴细胞(CD3+)、Th 细胞(CD3+CD4+)、NK 细胞(CD16+CD56+)百分比及Th 细胞/Tc 细胞比值较常规用药组明显升高，B 淋巴细胞(CD19+)百分比及免疫球蛋白IgM显著降低，提示热毒宁、甘草酸苷能显著地改善Ⅱ期HFMD患儿的细胞免疫功能紊乱情况，增强细胞免疫功能，通过多种途径间接抑制B细胞的活化增殖及IgM抗体的水平。联合用药组仅Th 细胞百分比及Th 细胞/Tc 细胞比值较热毒宁组显著升高，较甘草酸苷组略升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。这与本研究的预期设想：热毒宁联合甘草酸苷在治疗Ⅱ期HFMD患儿上较单独用药会产生叠加的治疗效果不一致，分析原因可能是：①热毒宁和甘草酸苷都通过多途径调节免疫反应，二者的免疫调节途径可能有部分相同，两种药物竞争同样的药物受体，因此免疫调节的作用被弱化；②热毒宁联合甘草酸苷对Ⅱ期HFMD患儿确有叠加作用(前面所述联合用药组较单用热毒宁或甘草酸苷组的临床疗效佳)，但免疫功能的影响因素有病原体、遗传、机体自身等诸多因素，加上本研究纳入研究对象选取上具有局限性，不足以检测出联合用药在免疫功能的叠加作用。联合用药组较单用热毒宁或甘草酸苷Ⅱ期HFMD患儿的T 淋巴细胞(CD3+)、Th 细胞(CD3+CD4+)、NK 细胞(CD16+CD56+)百分比及Th 细胞/Tc 细胞比值升高，虽他们之间的差异无统计学意义，但增加研究例数可能会验证这一结论。

总之，热毒宁、甘草酸苷能有效地改善Ⅱ期HFMD患儿临床症状和免疫功能紊乱，取得较好的治疗效果。然而，热毒宁联合甘草酸苷治疗HFMD患儿较单独用药是否有叠加作用仍需后续深入研究加以论证。