全外显子组测序在产前诊断中的应用及其发展方向

林晓莹 魏佳雪

(广东省第二人民医院 产前诊断中心，广东 广州 510317)

我国是出生缺陷高发国家，每年新增出生缺陷数约90万例，其中出生时临床明显可见的出生缺陷约有25万例[1]。同时，胎儿异常能在2%～5%的妊娠中被发现，且围产期死亡例数的20%[2-5]。因此，产前诊断是防治出生缺陷的重要内容。

出生缺陷病因包括环境因素和遗传因素，根据《全球出生缺陷报告》，全球每年出生遗传相关出生缺陷婴儿近800万，占出生总人数6%[6]。遗传性病因可分为染色体病(含基因组病)、单基因病和多基因病，传统产前诊断的主要手段如血清学筛查、超声检查和染色体核型分析已满足不了当前产前诊断发展的需要。近年来，产前分子诊断成为产前诊断的重要内容，荧光原位杂交技术、荧光定量 PCR 技术、多重连接依赖探针扩增技术和染色体芯片分析等已广泛应用于产前诊断的临床实践中，并有相应的指南和应用专家共识[7,8]。表1为美国妇产科医师学会(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)和母胎医学会(Society for Maternal-fetal Medicine，SMFM)对产前诊断检测技术应用情况的总结[9]。

表1 ACOG和SMFM关于产前基因诊断检测方法的总结

全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)是利用序列捕获技术可以将人基因组的外显子区域DNA捕获并且富集虽然外显子区域仅占全基因组1%～2%左右，却包含了85%的致病变异，目前推荐用于儿科和成人医学，例如有多个出生缺陷或神经发育迟缓而其他检测无法提供有效信息的临床适应证。 产后诊断数据显示WES在疑似患有某种遗传性疾病但未得到明确诊断的病例中的总体诊断率为25%～30%[10,11]。

然而，在实践中，许多单基因疾病在宫内会出现异常，这些异常能被超声检查发现，但核型和染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis, CMA)显示为正常未得到明确诊断时，其中6.2%～80.0%可用WES发现其致病变异[12-14]，而检出率的高低往往取决于临床能提供给WES分析的信息。WES提供准确的产前诊断信息，有助于选择妊娠结局、围产期管理方式和判断再发风险，做进一步的生殖指导等。

WES的应用可积极推动产前诊断的快速发展，但同时也面临着挑战和困难，因此本文将针对WES目前在产前诊断应用的优势和挑战进行探讨，并对其发展方向进行展望。

1 WES在产前诊断中的应用优势

1.1 WES有助于提高产前诊断的诊断率 对于超声检查异常而核型和CMA结果正常的产前诊断病例中，WES往往能作为有效的补充手段，有效检出致病变异，从而提高产前诊断的诊断率。Best[13]统计了截至2017年7月的WES的产前数据，发现WES总体诊断率在6.2%～80.0%，其中部分研究未在WES之前报告其有正常的核型或CMA结果，但在这些研究中，其诊断率也差异很大。这与Jelin等[15]统计的结果是一致的。WES的产前诊断率取决于提供分析的临床提示和以下的多种因素，包括：单一与多器官系统受累，特定器官系统受累，先证者WES 与家系WES(即Trio WES)[12,16]。

1.2 WES有助于为患儿的早期诊断和胎儿宫内治疗提供有效信息 产前在明确诊断后对某些遗传性疾病的胎儿可及时进行宫内治疗和对孕妇的分娩提前制定及采取合适的方案，以降低患儿的死亡率和患病率，从而更好地维护母婴的健康。例如，产前诊断丙酮酸脱氢酶缺乏症能使产后的及时治疗成为可能，有助于改善妊娠结局[17-22]。

有研究发现，宫内治疗成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)胎儿的效果要比在出生后再进行间充质干细胞移植治疗效果好，可减少患儿预期骨折的发生率及其后遗症[23]。很多OI病例是在妊娠期间发生新发突变，由于OI具有遗传异质性，因此WES能提供更加全面且快速的产前分子诊断，以便于提前进行宫内干预。

此外，产前WES能为患儿提供额外和准确的预后信息，以评估宫内手术的利弊，如在对严重脑室扩大的胎儿进行干预时应考虑是否要排除是否携带L1CAM突变[24]。

1.3 WES有助于人类胎儿发育的研究 由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)资助的几个中心目前利用WES来鉴定新基因[25]。虽然大多数新基因主要是在产后检测中被鉴定出来的，但与死胎或反复流产相关的，且需要通过产前WES或全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)来深入了解其功能的基因，也许对人类胎儿发展至关重要。

产前WES研究已成功识别以前未被识别的且与已知的孟德尔疾病基因相关的产前表型，以及鉴定新的人类发育障碍的候选基因，如KCTD1基因[26]。此外，产前WES研究有可能提高对致死性胎儿异常的遗传性疾病的了解，通常这些疾病完整的表型是未知的，如KIF14基因的研究[27,28]。

因此，研究工作者和临床实验室建议产前WES的临床信息数据库需要建立并且共享[15]，以便于临床的使用。

2 WES在产前诊断应用中的挑战

2.1 WES的方法局限性 WES的方法局限性主要表现在：①相关基因覆盖不全，例如HBB基因，其中一些致病变异发生在内含子上，而WES未能覆盖完全。这种情况需通过替代方法(如一代测序)进行补充，但由于产前所需的时间有限，这些替代方法并不总是可行。②WES对于重复序列和高GC含量的区域很难捕获[29]。③对有假基因的或有高度同源基因家族的基因难以检测，如HBA基因、IKBKG基因、CYP21A2基因等。④WES目前无法做到可靠地检测所有类型的遗传变异，如拷贝数变化、低水平镶嵌现象、非整倍性、结构染色体重排或三核苷酸重复，以及非编码区域中的变异。因此，目前，常规测试如微阵列等仍应与产前WES同时考虑，特别是当临床怀疑已知的遗传性综合征的产前表现时。

2.2 产前WES的遗传咨询 WES的遗传咨询在产前诊断中所面临的困难要比在产后更为艰巨，因为产前诊断的结果往往影响着妊娠结局，这不仅会给孕妇及其家庭带来重要影响，也关乎到胎儿的生命，尤其在我国目前医患关系紧张的情景之下，如何对WES的结果进行正确地判读得到明确诊断，如何将产前诊断结果清楚地解释给孕妇及其家庭就显得至关重要。

产前WES的遗传咨询所面临的挑战主要来源于3个方面：①胎儿表型信息的不确定性。首先，因超声医师水平差异，胎儿结构异常可能出现过度诊断或漏诊可能；再者，单基因病胎儿微妙表型异常在产前超声中难以明确，且有一些遗传性疾病可能存在不完全外显、表型多样性或者迟发等复杂的遗传背景，且许多孟德尔遗传病的表型还是无法通过超声等手段观察到，例如生长延缓、智力发育障碍等；此外，ClinVar数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) 和人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database，HGMD)(http:∥www.hgmd.org)等能给产后表型-基因型提供参考信息，也有相关文献探讨了这两个数据库的应用价值[30,31]。而目前尚未有类似的产前表型-基因型数据库。②对变异的解读，尤其是对临床意义未明变异的解读。美国医学遗传学和基因组学(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南明确将变异进行分类，并对其报告的原则和要求进行说明[32]。但在实践工作中，医院和第三方检测机构的实验室是否都能严格按照ACMG指南要求进行解读，分析人员水平的差异以及临床医生对遗传学知识的掌握程度等都给临床诊断及咨询服务带来挑战。③对次要或偶然发现的处理。对于产后WES，ACMG建议临床实验室积极寻找并报告59个基因中的已知的致病变异和疑似致病变异，这些基因与肿瘤和心脏病的易感性有很大的关联[33]，并且可在大约1%的人口中发现[34]。对于产前WES的次要发现，其具体实践尚未找到相应的指南或准则。对于是否要报告次要发现或意外发现，建议要在检测前知情同意中告知胎儿的父母，这与大多数专家的意见也是一致的[35]。

2.3 WES在产前诊断应用的社会伦理学问题 产前WES引起的社会伦理学问题一直备受关注且有争议[35]。首先，产前诊断本身就否定了胎儿作为一个生命的自主权[36]；其次，基于产前诊断信息，父母有可能选择终止妊娠或是产后有不对等的抚养方式，这都有可能给父母和孩子带来沉重的心理负担[37]，因此必须仔细权衡这其中的利弊。此外，对于次要或偶然发现，尤其是出现非亲子或非伦理父母血缘关系的意外问题，母亲需要单独接受咨询，且有做出是否报告的选择权。

2.4 WES在产前诊断应用的费用 目前，目标区域检测、WES和WGS都是依靠第一代测序技术(next generation sequencing, NGS)平台发展的产物，它们的区别在于覆盖的基因数和区域有所不同，例如目标区域检测多是把同一疾病或同一系列疾病相关的基因组合在一起，往往包括几个至上百个基因；WES覆盖了人类基因组2万多个基因的外显子区域；而WGS则是覆盖了人类基因组所有已知或未知基因的外显子区和内含子区。随着测序成本的降低，目标区域检测，WES和WGS的成本差异主要在于对变异分析的成本，包括分析团队的人力成本、数据处理及储存的成本和分析所需的时间成本。因此，目标区域检测成本收费较低，WES次之，WGS难度最大，价格也就越高。

对于产前诊断，相比目标区域检测和WGS，Trio WES是较为全面且经济快速的检测方法。目前对于产前WES的经济效益尚未得到正式地评估，但从产后大规模样本来看，WES的应用更有利于节省医疗费用[38]。

3 WES的未来发展方向

随着技术不断改进，测序成本的降低和生物信息分析能力的优化，WGS的应用是势必发展的。目前，也有不少在临床应用WGS的报道[39-41。然而，WGS覆盖的范围比WES更广，所能挖掘的信息更多，这比WES的应用需要面临更多的困难，尤其在解读咨询上，因此这也限制了WGS目前的广泛应用。

无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)是利用母体外周血浆中胎儿游离DNA进行分析的一种检测方法，目前多应用于筛查胎儿21、18、13-三倍体的非整倍体异常，也能检测出一些单基因遗传病[42]。在技术层面上，利用母体外周血浆中胎儿游离DNA进行WES或WGS检测是可以实现的，但不成熟，仍需要解决如WGS可能出现覆盖不全、假阳性率和假阴性率高、需要排除胎盘嵌合等问题[43]。

单细胞测序允许对单个细胞进行特异性分析，单细胞的WES和WGS测序也早有报道，多应用于植入前诊断中对非整倍体、拷贝数变异(copy number variations，CNVs)和某些单基因疾病的检测[44]。采用胎盘不同位置的多个细胞进行单细胞测序分析有助于排除母体污染或胎盘嵌合的问题，在产前诊断中的应用有很大的潜力。

综上所述，在超声检查异常而核型和CMA分析结果正常的胎儿中，WES能提高其产前诊断率，且其诊断范围增加且分散，极大提高罕见病检出率。2018年发表的关于使用全基因组测序进行胎儿诊断的联合立场声明及2020年1月发表的ACMG对胎儿外显子测序(exome sequencing，ES)在产前诊断中应用的意见中均已提出在胎儿超声异常，但核型及CMA正常的情况下可采用测序进行检测[45,46]。但是，WES的应用同时带来一系列挑战，包括技术、应用、伦理、经济等，仍不建议常规使用WES进行产前诊断[45,47]，需进一步证实技术可行性及临床效力。