肌肉生长抑制素(MSTN)对猪脂肪细胞脂解的影响及其机制

王珏，张琳，刘壮，邢华, 2，李辉，盛昊天，潘士锋, 2*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

畜禽体脂的过量沉积除了严重降低其胴体品质和生产性能以外，还与人类肥胖、Ⅱ型糖尿病和胰岛素抵抗等多种代谢性疾病的多发密不可分[1-3]。有关畜禽体脂沉积方面的研究一直以来都是畜牧兽医行业和生物医学领域关注的热点和难点。体脂沉积量增加主要是脂肪细胞数目的增加、脂肪细胞容积的扩大以及脂滴聚集共同作用的结果，其中脂肪细胞容积增大除了受脂肪细胞的成脂分化影响外，还与脂肪分解程度密切相关[4-5]。因此，在基因水平上探索影响畜禽脂肪分解的分子机理，寻找调控脂肪沉积的重要候选基因，能为畜禽肉质性状的改善以及人类代谢性疾病的预防提供新思路。

脂肪分解是在一系列脂肪分解酶的作用下，对细胞内脂质进行逐级水解的过程，其中激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase, HSL)和脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)是细胞内脂质水解的关键限速酶[6-7]，这两种基因的表达变化能在一定水平上反映脂肪分解能力以及决定最终的脂质沉积量。在脂肪细胞中，脂质主要是以甘油三酯(triglyceride, TG)的形式储存在脂滴中。基础状态下，在脂滴表面覆盖脂滴包被蛋白(Perilipin)和脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation related protein, ADRP)，能够形成一道“天然屏障”阻止胞液中HSL和ATGL对TG的水解，对细胞内TG的储存具有非常重要的保护作用。但是，当细胞受到刺激导致脂解信号增强时，脂肪细胞Perilipin和ADRP表达水平降低，从而导致其对脂滴的保护作用大大减弱，使得HSL和ATGL大量进入脂滴，使TG分解为甘油和游离脂肪酸[8-9]。

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，是一种主要由肌肉组织分泌的蛋白质，除对肌肉生长有负调控作用外，近年来的研究表明其对脂肪组织中TG的代谢也有双重调节作用，抑制或促进脂肪沉积[10-12]，因此MSTN可以作为调控脂肪沉积的重要候选基因，但其具体作用及机制仍需进一步阐明。我们前期研究表明，MSTN呈剂量依赖性抑制猪脂肪细胞的增殖和成脂分化，然而其对脂肪细胞脂解的调控作用及其分子机制尚不清楚。因此，本试验继续以猪前体脂肪细胞为研究材料，以脂肪分解作为切入点，通过研究MSTN处理对猪脂肪细胞中TG沉积量，细胞上清中甘油和游离脂肪酸的释放量，以及脂肪分解相关基因Perilipin、ADRP、HSL和ATGL表达的影响，深入探讨其对猪脂肪细胞脂解的影响及可能的分子机制。研究结果对于筛选调控猪肉品质的分子靶点具有重要意义，同时还为治疗和预防人类相关疾病提供重要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 组织来源

35日龄断奶雄性仔猪第6～7肋骨皮下脂肪组织。

1.2 主要试剂

兔多抗(BS91052、BS8094、AP0372、BS7989)和鼠多抗(AP0060)均购于Bioworld公司；TRIzol总RNA提取试剂盒、反转录酶(M-MLV)、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)、随机引物(random hexamer primers)和SYBR GREEN(A3475L，TOYOBO，JAPAN)购于南京生兴生物技术有限公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松(DEX)和胰岛素(Insulin)购买于Sigma公司；甘油三酯定量检测试剂盒(E1014)、RIPA裂解液(C1503)和蛋白酶抑制剂混合物(P1265)购于北京普利莱基因技术有限公司；甘油含量测定试剂盒(F005-1-1)、BCA法蛋白定量试剂盒(#P1511)和游离脂肪酸含量测定试剂盒(A042-2-1)购买于南京建成生物工程研究所。用于mRNA表达检测的Perilipin、ADRP、HSL、ATGL和内参肽基脯氨酰异构酶(peptidylprolyl isomerase A PPI)A的PCR引物(序列见表1)均合成于苏州金唯智生物科技有限公司。

表1 PCR引物序列

1.3 细胞分离及培养

无菌分离断奶雄性仔猪第6～7肋骨皮下脂肪组织，用含5倍双抗的PBS冲洗3～5次，剔除血管及筋膜，然后迅速转移入无血清培养基中剪碎，剪成1 mm3的小块即可，充分消化后，依次用50、100、200、400、600目的细胞筛过滤消化液。将过滤液进行离心，2 000 r/min离心10 min，沉淀物用无血清培养基重悬，如此操作重复2次，获得细胞母液。经计数细胞后稀释，细胞接种密度为3×104个/cm2，增殖培养至85%～95%融合细胞，利用“鸡尾酒”法诱导分化，鸡尾酒包含0.1 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.25 μmol/L 地塞米松(DEX)，5 μg/mL 胰岛素；与此同时进行不同浓度MSTN重组蛋白的处理；试验共分为4组。1组为对照组，分化培养液(DM)+0 ng/mL MSTN重组蛋白；2、3、4组为处理组，分别为DM+25、50、100 ng/mL MSTN重组蛋白；分化48 h后收集细胞和细胞上清，进行后续分析。

1.4 检测MSTN处理后细胞上清中甘油和游离脂肪酸(FFA)浓度

甘油和FFA作为TG的水解产物，其含量是TG水解反应程度的可靠检测指标。本试验中利用甘油和FFA含量测定试剂盒分别检测MSTN处理48 h后细胞上清中甘油和FFA的浓度，具体操作见试剂盒说明书。

1.5 检测MSTN处理后猪前体脂肪细胞中TG沉积量

使用甘油三酯定量检测试剂盒检测脂肪细胞中TG的沉积量，具体操作见试剂盒说明书。大致流程如下：猪前体脂肪细胞以3×104个/cm2密度进行接种6孔板，诱导分化的同时，进行不同浓度MSTN处理，48 h后吸弃上清，并用PBS洗涤2次以去除甘油，加裂解液(按比例每1×106个细胞加入0.1 mL裂解液)，混匀后室温静置10 min进行裂解，离心取上清使用多功能酶标仪检测OD490，并使用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，以每微克蛋白浓度校正TG含量。

1.6 检测MSTN处理后脂肪细胞脂肪分解相关基因mRNA表达

使用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA(具体操作见试剂盒说明书)，使用Nanodrop分光光度计(ND-2000)测定总RNA的浓度和纯度(A260/A280=1.8～2.0)，然后经RNA变性胶验证合格后，利用M-MLV反转录试剂盒对2 μg RNA进行反转录，获得cDNA。采用荧光定量PCR方法检测Perilipin、ADRP、HSL和ATGL基因mRNA的表达，以PPIA作为内参。

1.7 检测MSTN处理后脂肪分解相关基因蛋白表达

使用总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，变性，-80 ℃保存备用。使用Western blot方法检测蛋白Perilipin(兔多抗1∶1 000稀释、ADRP(兔多抗1∶500稀释)、HSL(兔多抗1∶1 000稀释)和ATGL(兔多抗1∶1 000稀释)的蛋白表达水平，用β-actin(鼠多抗，1∶5 000稀释)作为内参标准化。

1.8 数据的统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，每个试验重复3次，数据用平均数±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 MSTN处理对猪脂肪细胞TG沉积量的影响

TG定量检测结果表明，25、50和100 ng/mL MSTN处理组脂肪细胞中，TG沉积量均显著低于对照组DM+0 ng/mL MSTN细胞，并且呈逐渐降低趋势，表明MSTN处理能呈浓度依赖性抑制猪脂肪细胞内TG沉积量(图1)。

注：不同字母表示组间相比差异显著(P<0.05)，n=6/组，下同图1 MSTN处理对猪脂肪细胞中TG沉积量的影响

2.2 MSTN处理对猪脂肪细胞上清中甘油和FFA含量的影响

进一步检测猪脂肪细胞上清中甘油和FFA的含量，以确定脂肪细胞胞浆中TG的水解是否升高，结果如图2所示。与对照组DM+0 ng/mL MSTN细胞相比，DM+25 ng/mL MSTN，DM+50 ng/mL MSTN和DM+100 ng/mL MSTN处理组猪脂肪细胞细胞上清中甘油和FFA的释放量均显著增加，且呈现由低浓度向高浓度逐渐升高的趋势，表明MSTN处理显著促进了猪脂肪细胞内脂肪水解过程，并且呈浓度依赖性。

图2 MSTN处理对猪脂肪细胞上清中甘油和FFA含量的影响

2.3 MSTN处理对脂肪细胞脂解相关基因表达的影响

qRT-PCR研究结果表明，与DM+0 ng/mL MSTN的对照组细胞相比，脂滴包被蛋白Perilipin和ADRP mRNA表达水平在DM+100 ng/mL MSTN处理组细胞中均显著降低。Western blot结果显示，与对照组细胞相比，DM+100 ng/mL MSTN处理显著抑制了ADRP的蛋白表达及Perilipin蛋白的磷酸化(图3A、B、C)。此外，脂肪分解的关键限速酶基因HSL和ATGL的mRNA表达量，在DM+100 ng/mL MSTN处理组细胞中显著升高。对脂肪分解酶蛋白表达的检测结果显示，与对照组DM+0 ng/mL MSTN细胞相比，经DM+100 ng/mL MSTN处理组，显著增加了HSL和ATGL脂肪分解酶的蛋白表达(图3D、E、F)。

A. Perilipin和ADRP的mRNA表达；B、C. Perilipin和ADRP蛋白表达；D. HSL和ATGL的mRNA表达；E、F. HSL和ATGL的蛋白表达；**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)；n=6/组图3 MSTN处理对脂肪细胞脂肪分解相关基因表达的影响

3 讨论

哺乳动物的白色脂肪组织具有以脂质形式储存和释放能量的能力，在维持机体能量平衡中起着关键作用[13]。脂肪组织的过量积聚(畜禽成年后主要是脂肪细胞体积增大)是导致肥胖及多种代谢性疾病的诱因[14]。因此，脂肪细胞是研究和开发肥胖治疗新策略的重要目标之一。在细胞和分子水平上研究脂肪细胞增殖和肥大(脂肪细胞分化和脂肪分解)机理，通过筛选有效靶点调节脂肪细胞数目的多少和体积的大小，不仅对减少畜禽体脂沉积，提高畜禽产品品质具有重要意义，而且还为人类肥胖及相关代谢性疾病的预防与治疗提供重要理论依据。另外，猪是最接近人类的模式动物，是研究人类肥胖和代谢性疾病的最理想动物模型之一。与以往大多数脂肪代谢都以啮齿动物或细胞系为研究对象不同，本研究中选择原代培养的猪前体脂肪细胞为研究对象，一方面因为与啮齿类动物相比，猪在解剖学和生理学上与人类的亲缘关系最近，是目前公认的研究人类代谢性疾病最为理想的动物模型之一[15]。另一方面，与细胞系相比，原代细胞的性状和生物学特性更接近机体的生理状态，更有利于筛选调控脂肪细胞成脂分化和脂解的分子靶点。

脂肪细胞体积的增大，主要是细胞内脂滴的体积增大导致的，而脂滴的主要成分是TG，TG的沉积量除了与成脂分化改变有关外，还与TG的分解程度有直接关系。课题组前期研究结果及本试验结果均表明，MSTN处理能呈浓度依赖性抑制脂肪细胞内TG的沉积量，表明MSTN能显著抑制脂肪细胞脂质沉积，这与以往在小鼠3T3-L1前体脂肪细胞和牛前体脂肪细胞中所获得的研究结果一致[16-19]。此外，前期的研究结果还表明，MSTN处理显著抑制猪脂肪细胞内TG的沉积量与脂肪细胞成脂分化标志基因PPAR-γ及其下游脂肪合成关键酶FAS和ACC的mRNA和蛋白表达显著降低密切相关，表明MSTN是通过抑制猪脂肪细胞的成脂分化，进而减少脂肪的合成，来降低细胞内脂质积累。这与其他学者在小鼠3T3-L1细胞上所得到的结果一致[16-17]。然而也有不同的看法。有研究发现，MSTN能通过促进CEBP-α和PPAR-γ的表达，促进多功能间充质干细胞分化为脂肪细胞[20-22]。造成这种差异的原因可能跟细胞的种类及来源不同有关。

成熟脂肪细胞中，绝大部分空间被脂滴覆盖，而脂滴的主要成分就是TG，在脂肪分解因素刺激下，TG可被水解为FFA和甘油。本研究结果显示，与0 ng/mL的MSTN组相比，25、50和100 ng/mL的MSTN处理剂量依赖性增加了细胞上清中甘油和FFA的释放量，表明MSTN处理显著激活了脂肪细胞内的脂肪分解过程。脂肪分解是一个复杂的调控过程，涉及到几种脂肪分解酶、辅助因子和脂滴相关蛋白的协同参与，其中HSL和ATGL是脂肪分解的两种关键限速酶，其表达量的高低直接决定着脂肪分解程度。本研究发现，与0 ng/mL MSTN组相比，100 ng/mL的MSTN处理显著增加了HSL和ATGL的mRNA及蛋白表达，表明MSTN处理显著增强了脂肪细胞内脂肪分解过程。前期在小鼠3T3-L1前体脂肪细胞的研究表明，MSTN处理可通过抑制PPAR-γ和CEBP-α的表达抑制脂肪生成，并促进脂肪分解(从细胞上清中甘油和游离脂肪酸释放量增加可知)来减少脂质积累，这与本研究结果相同[16]。然而不同的是，在3T3-L1细胞上的研究结果表明，MSTN处理促进脂解主要是通过增加HSL和ATGL的表达，抑制CPT1的表达来实现的。本试验在猪脂肪细胞上的研究结果虽表明MSTN处理显著促进了脂解，但仅发现HSL和ATGL表达的升高，MSTN处理能否影响CPT1的表达还需要进一步探讨。

以往研究表明，Perilipin和ADRP是脂滴蛋白家族主要成员，基础状态下，未磷酸化的Perilipin可阻止脂肪分解酶接近脂滴，能在很大程度上抑制中性脂质的水解。而在脂解因素刺激下，Perilipin可被PKA磷酸化，从而使可溶性的脂肪分解酶磷酸化异位至脂滴表面，此时其与磷酸化的Perilipin共定位于脂滴表面，从而刺激脂解。本研究进一步的试验结果表明，与对照组细胞相比，100 ng/mL的MSTN处理显著降低了Perilipin和ADRP的mRNA及蛋白表达，表明100 ng/mL的MSTN处理导致脂肪细胞内脂肪分解增强有可能与Perilipin和ADRP表达量的下降有密切关系。

前期的研究结果还表明，100 ng/mL的MSTN处理可通过降低PPAR-γ的mRNA及蛋白表达，显著抑制脂肪细胞的成脂分化，这与以往在3T3-L1细胞上的研究结果一致[16]。以往研究表明，在Perlipin基因启动子区域，含脂肪细胞分化的关键转录因子PPAR-γ结合原件(PPRE)，在分化的脂肪细胞中，Perlipin表达主要受PPAR-γ调控[23]，在3T3-L1脂肪细胞中添加PPAR-γ激动剂，通过结合Perlipin基因启动子区域的PPRE，显著上调Perlipin基因的表达。因此，结合两部分的研究结果表明，100 ng/mL的MSTN处理后Perlipin表达量的下降有可能与PPAR-γ表达量的下降密切相关。

总之，本研究结果表明，MSTN能通过抑制脂肪细胞分化关键转录因子PPAR-γ的表达，抑制脂滴表面保护性蛋白Perilipin和ADRP的表达，进而增加脂肪分解关键酶基因HSL和ATGL的mRNA及蛋白表达，促进细胞内TG的分解，从而抑制猪脂肪细胞内TG的沉积。研究结果为MSTN作为调控脂肪细胞脂质沉积分子靶点的确认提供理论依据。