金樱子果肉与果核UPLC特征图谱与化学模式识别方法研究

刘燎原，田清清，林伟雄，曾昭君，梁志毅，张志鹏

(广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

金樱子为蔷薇科植物RosalaevigataMichx.的干燥成熟果实，是花托发育而成的假果，花托壁厚，内有多数坚硬的小瘦果，内壁与瘦果均有淡黄色绒毛[1]。金樱子需求量连年增加，价格持续上涨，临床上去核费工费时，多数医院宁可不购进未炮制好的金樱子，导致临床配方缺用[2-3]。关于金樱子果实不同部位多糖等成分含量的差异性分析[4-6]，无法全面表征金樱子果实不同部位化学成分整体的差异性。目前有对金樱子全果实的指纹图谱研究[7-9]，但针对果实不同部位研究较少。本研究建立一种简单快速的UPLC检测方法，能同时测定金樱子儿茶素含量及特征图谱，并结合化学模式识别方法[10-11]全面评价金樱子果实不同部位的差异性，探讨金樱子去核使用的科学性。

1 仪器与材料

Waters H-Class型超高效液相色谱仪(TUV检测器，Empower工作站，Waters公司)；111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)；XP26百万分之一天平(Mettler Toledo公司)；ME204E万分之一天平(Mettler Toledo公司)；JJ2000B型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)。

儿茶素对照品(批号：110877-201604，纯度99.2%，中国食品药品检定研究院)；甲醇、磷酸、乙腈(色谱纯，默克股份有限公司)；超纯水(Mili-Q Direct，默克股份有限公司)；其余试剂均为分析纯。

11批金樱子经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为正品，符合2015年版《中国药典》一部金樱子项下相关规定，产地分别来自广西、江西、湖北、湖南等地。金樱子全果实编号为S1～S11，果肉编号为Y1～Y11，果核编号为H1～H11。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters HSS T3 C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流动相为甲醇-0.05%磷酸(4∶96)，等度洗脱，检测波长为202 nm，体积流量为00.35 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为1 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 取儿茶素对照品约4 mg，精密称定，加甲醇定容至20 mL，得到对照品储备液浓度为204.947 2 μg·mL-1，备用。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取金樱子粉末(过三号筛)0.3 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称定重量，加热回流提取0.5 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，配制成5.123 7、10.247 4、20.494 7、51.236 8、102.473 6 μg·mL-1的对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别测定，以儿茶素的峰面积为纵坐标(Y)，以质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=40 790.092 3X-17 816.732 2，r=0.999 9，结果表明儿茶素质量浓度在5.123 7～204.947 2 μg·mL-1内与峰面积积分线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精密吸取浓度为20.494 7 μg·mL-1的儿茶素对照品溶液，平行进样6次，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积积分值，儿茶素峰面积积分的RSD为1.27%；以儿茶素峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD< 2%，结果表明精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批次金樱子粉末，精密称定，平行称定6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别测定，供试品溶液中儿茶素的平均含量为1.555 mg·g-1，RSD为2.42%；以儿茶素峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD< 3%，结果表明重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批次金樱子粉末，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，在0、2、4、6、8、12 h分别测定，测得供试品溶液中儿茶素峰峰面积的RSD为0.66%；以儿茶素峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积。实验结果表明，12 h内各色谱峰相对保留时间与相对峰面积的RSD< 3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取已测定含量的金樱子样品，精密称定，分别精密加入一定量的儿茶素对照品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液9份，按照“2.1”项下色谱条件分别测定，计算儿茶素加样回收率及RSD值，平均加样回收率为101.7%，RSD为2.04%，结果见表1，表明回收率良好。

表1 儿茶素加样回收率试验结果 (n=9)

2.4 含量测定

取上述11批金樱子，分离果肉和果核，取果实、果肉、果核三个部位，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。计算金樱子不同部位中的儿茶素含量，结果见表2。

表2 金樱子不同部位中的儿茶素含量测定结果 (mg·g-1，n=11)

2.5 特征图谱测定

2.5.1 特征图谱的建立 取11批果实、果肉、果核样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图，分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)”，生成共有对照特征图谱(见图1、图2、图3、图4)，果实、果肉、果核分别标定了13、12、9个共有峰。与对照品对照指认12号峰为儿茶素，并以其作为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表3和表4。

表4 金樱子样品共有峰相对峰面积

表3 金樱子样品共有峰相对保留时间

续表3

图1 11批金樱子果实UPLC特征图谱

图2 11批金樱子果肉UPLC特征图谱

图3 11批金樱子果核UPLC特征图谱

A.儿茶素对照品；R(S)果实；R(F)果肉；R(E)果核

2.5.2 相似度评价 将金樱子果实、果肉、果核色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行相似度分析(见表5)，结果显示金樱子果实与果肉的相似度较高，其次为果实与果核，果肉与果核相似度较低。

表5 金樱子果实不同部位特征图谱相似度结果

2.5.3 化学模式识别分析 运用SPSS 20.0、Past 3.0软件对数据进行聚类分析和主成分分析，建立11批金樱子不同部位的聚类分析(CA)树状图和主成分分析(PCA)图。

(1)聚类分析。11批金樱子不同部位特征图谱CA结果如图5所示。由CA结果可知，可将11批金樱子不同部位共33个样本聚为三类，其中果实共聚为一类(Ⅱ类)，果肉共聚为一类(Ⅲ类)，果核共聚为一类(Ⅰ类)。由于不同批次间金樱子果实存在一定差异性，导致聚类分析过程中有一批果实(S5)聚在了果核类别。金樱子不同部位特征图谱聚类分析结果表明，基本可将金樱子果实、果肉、果核之间区分开。

图5 金樱子果实不同部位聚类分析(CA)树状图

(2)主成分分析。11批金樱子不同部位特征图谱PCA结果如图6所示，主成分1(PC1)、主成分2(PC2)的累积贡献率达到98.5%，表明所构建的模型预测能力良好。绘制的二维得分散点图显示出可将11批金樱子不同部位共33个样本分为三类，果实、果肉、果核不同部位之间可完全分开。

图6 金樱子果实不同部位主成分分析(PCA)得分散点图

3 讨论

3.1 供试品制备方法考察

分别考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇4种提取溶剂对金樱子特征图谱的影响，结果表明，当采用乙醇作为提取溶剂时，色谱峰数目较少，溶剂效应影响大，而50%甲醇提取效率最高，色谱峰数目较多，溶剂效应影响较小。同时考察了提取方式(加热回流和超声提取)和提取时间(15、30、45、60 min)，结果表明采用加热回流提取效果明显高于超声提取，提取时间对提取效率影响不大，加热回流提取30 min基本可提取完全，故供试品制备方法确定为加入50%甲醇，加热回流提取30 min。

3.2 色谱条件优化

通过对比不同的有机相(甲醇和乙腈)、不同的水相(水、0.05%磷酸、0.1%甲酸、0.1%乙酸)作为流动相的色谱图，当选取甲醇-0.05%磷酸溶液作为流动相时，色谱峰的信息较完整且分离度较好。故最终选定甲醇-0.05%磷酸系统作为流动相。为确定最佳检测波长，按照“2.1”项下色谱条件进行实验，分别于202 nm、254 nm、290 nm波长处测定。结果表明，检测波长为202 nm时，各特征峰响应值较大，基线平稳，干扰较小，因此确定202 nm作为最佳检测波长。

3.3 含量及特征图谱结果讨论

由金樱子不同部位儿茶素含量结果可知，果实、果肉与果核之间儿茶素含量存在显著性差异，果肉中儿茶素的含量高于果核5倍，计算11批果核与整个果实重量的比例，约为50%。研究表明[12-13]儿茶素味感主要表现为涩味，涩味强度随儿茶素浓度增加而呈线性增强，因此，金樱子涩味主要来源为果肉，与其涩精气功效密切相关。以金樱子果实UPLC特征图谱标定的13个共有特征峰为参照，在相同色谱条件下测定果肉与果核，结果显示7、8、9号共有峰在果肉中能明显检测出而在果核中未能检测出，6号共有峰在果核中能明显检测出而在果肉中未能检测出。金樱子果核儿茶素含量低，所占果实比例大，化学成分与果肉也存在明显的差异，因此金樱子临床用药去核使用具有一定意义，该用法是否与古籍文献中所述的“其腹中之子，偏能滑精，煎膏不去子，全无(功)效也”(清·《新编》)药效对应，还有待进一步深入研究。

3.4 化学模式识别分析

本实验在建立金樱子果实不同部位UPLC特征图谱的基础上，结合化学模式识别方法进行聚类分析和主成分分析，不同模式下均可将金樱子果实、果肉、果核分别聚类而区分开，表明金樱子果实中不同部位的整体化学成分是存在显著差异的。本研究方法可用于金樱子果实不同部位的鉴别，对于金樱肉饮片质量控制及临床去核使用准确用药具有重要的指导意义。