蛤蚧不同炮制品的抗疲劳作用研究

黄馨慧，熊桂玉，刘舒凌*，王晓珊，张 兵，朱明凤

(1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530021；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001)

蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus除去内脏的干燥体，其性平味咸，归肺、肾经，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效，常用于肺气不足、虚喘气促、劳嗽咳血、阳痿的治疗[1]。近年来蛤蚧研究多集中于补肾壮阳、抗肿瘤等药理研究，并发现蛤蚧可以增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、促进造血功能、清除机体内的自由基[2]，而对蛤蚧及其不同炮制品的抗疲劳作用的研究较少。蛤蚧不同炮制品是否均有抗疲劳作用，不同炮制品的抗疲劳作用是否有区别，目前尚无文献报道。本课题拟研究蛤蚧不同炮制品(生品、酒制品、油酥制品、蛤粉制品)的抗疲劳作用，以期为蛤蚧炮制品的临床合理应用，以及阐明其炮制原理提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级昆明种小白鼠，雄性，体质量18～22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK(湘)2016-0002。

1.2 药物与试剂

蛤蚧购于安徽亳州中药材市场，经广西中医药大学中药鉴定教研室樊兰兰副研究员鉴定为壁虎科动物蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus)的干燥药材。金匮肾气丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，18030641)；会稽山绍兴花雕酒特醇绍兴花雕酒(会稽山绍兴酒股份有限公司，20161117)；金龙鱼芝麻油(益海嘉里(武汉)粮油工业有限公司，LH20160122)；蛤粉(广西仙茱中药科技有限公司，20170620)；乳酸测试盒(南京建成生物工程研究所，20190305)；尿素检测试剂盒(宁波瑞源生物科技有限公司，2019012901)；肝/肌糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所，20190511)。

1.3 仪器与设备

高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司，111B)；小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf，5430 R)；电子天平(德国赛多利斯公司，BP211D)；电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣仪科学仪器有限公司，DHG-9140A)；电炒锅(广西柳州龙腾电器厂，LT-116)；全自动生化仪(罗氏集团，P800型)；紫外可见分光光度计(美国安捷伦公司，Aglient8453)。

2 方法

2.1 样品制备

蛤蚧样品制备：取干燥蛤蚧除去鳞片、足，齐眼处切去头，切成大小均匀的小块。酒蛤蚧样品制备：取净蛤蚧块用黄酒浸润后，加热烘烤至外表微黄时，取出放凉，每100 g蛤蚧，用黄酒20 g[3]。油酥蛤蚧样品制备：取净蛤蚧，涂以麻油，烘至稍黄质脆，去头(齐眼处切除)、足及鳞片，切成小块[4]。蛤粉炒蛤蚧样品制备：取净蛤蚧块，照蛤粉烫制法，烫至黄色，质酥脆，取出，筛去蛤粉[5]。将以上各炮制品分别打粉，过60目筛，贮存于4 ℃冰箱备用，使用前用生理盐水配成相应浓度。

2.2 动物分组、给药及筛选

小鼠按体重随机分为6组，即空白组、阳性组、蛤蚧组、酒蛤蚧组、油酥蛤蚧组、蛤粉制蛤蚧组。阳性组(金匮肾气丸)给药剂量1.3 g/kg，蛤蚧组、酒蛤蚧组、油酥蛤蚧组、蛤粉制蛤蚧组的给药剂量为1.2 g/kg，小鼠灌胃体积是0.2 mL/10 g/只，空白组灌胃等体积蒸馏水，每天灌胃1次，灌胃给药21 d。在给药期间，小鼠每周进行1～2次适应性游泳训练，剔除不会游泳的小鼠。各组筛选出游泳训练合格小鼠进入下一步实验。

2.3 小鼠负重力歇游泳时间测定

取小鼠72只，分组、给药及筛选参照“2.2”项。末次给药30 min后，在小鼠尾巴上负荷其体重7%的铅丝，放入装有水温(25±2) ℃、水深40～50 cm的大铁桶中进行负重力竭游泳。记录小鼠游泳开始至完全沉入水中10 s仍不能冲出水面的时间，即为负重力歇游泳时间。

2.4 小鼠游泳后血清乳酸含量测定

取小鼠72只，分组、给药及筛选参照“2.2”项。末次给药30 min后，将小鼠放入装有水温(25±2)℃、水深40～50 cm的大铁桶中进行无负重游泳10 min，取出后立即用干毛巾擦干小鼠眼睛周围，随即摘眼球取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，检测血清乳酸含量。

2.5 小鼠游泳后血清尿素氮含量测定

取小鼠72只，分组、给药及筛选参照“2.2”项。末次给药30 min后，末次给药30 min后，将小鼠放入装有水温(25±2)℃、水深40～50 cm的大铁桶中进行无负重游泳90 min，取出后休息30 min后，立即摘眼球取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，检测血清尿素氮含量。

2.6 小鼠游泳后肝糖原含量测定

取小鼠60只，分组参照“2.2”项。各组连续灌胃给药21 d，末次给药30 min后，处死小鼠，取新鲜肝脏，用生理盐水漂洗，滤纸拍干后，按肝糖原试剂盒说明书进行肝糖原测定。

2.7 数据统计分析

3 结果

3.1 对小鼠负重力歇游泳时间的影响

与空白组对比，金匮肾气丸组、蛤蚧组、酒蛤蚧组、油酥蛤蚧组、蛤粉制蛤蚧组小鼠的负重力歇游泳时间无统计学差异(P>0.05)。与蛤蚧组相比，油酥蛤蚧、蛤粉制蛤蚧虽然游泳时间高于蛤蚧组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 蛤蚧不同炮制品对小鼠负重力歇游泳时间的影响

3.2 对小鼠游泳后血清乳酸水平的影响

与空白组比较，金匮肾气丸组、蛤蚧各炮制品组小鼠运动后的血清乳酸含量显著降低(P<0.01)。与蛤蚧组比较，金匮肾气丸组、油酥蛤蚧组的血清乳酸含量明显升高(P<0.05)。酒蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的血清乳酸与蛤蚧组差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 蛤蚧不同炮制品对游泳后小鼠血清乳酸含量的影响

3.3 对小鼠游泳后血清尿素氮水平的影响

与空白组相比，金匮肾气丸组尿素氮水平显著降低(P<0.05)，蛤蚧不同炮制品组无统计学差异(P>0.05)。与蛤蚧组相比，酒蛤蚧组尿素氮含量显著升高(P<0.05)，油酥蛤蚧组、蛤粉制蛤蚧组无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 蛤蚧不同炮制品对游泳后小鼠血清尿素氮含量的影响

3.4 对小鼠肝糖原含量的影响

与空白组相比，蛤蚧不同炮制品组能升高肝糖原含量(P<0.05)。与蛤蚧组相比，酒蛤蚧组、油酥蛤蚧组、蛤粉制蛤蚧组无统计学差异(P>0.05)。见表4。

表4 蛤蚧不同炮制品对小鼠肝糖原含量的影响

4 讨论

蛤蚧生品味腥，质地柔韧，不易粉碎调剂。蛤蚧炮制后可以矫臭矫味，改善口感，便于粉碎和调剂。蛤蚧炮制方法有多种，传统炮制技术有酒制、酥制、醋制等，少数民族尚有醋浸烤制、奶油烤制等方法[6]。蛤蚧生品以补肺益精、纳气定喘见长，为肺肾两虚、肾不纳气、久咳虚喘要药，常用于肺虚咳嗽或肾虚作喘[7]。蛤蚧酒浸焙、酒浸酥炙借酒行药势增强补肾的作用，多用于肾阳不足、精血亏损的阳痿[8]。油酥蛤蚧，腥气减少，气香，便于粉碎，其功效为补肾益肺、纳气定喘，常用于肺虚咳嗽或肾虚作喘的治疗[9]。用蛤粉烫制蛤蚧可增强止咳平喘的作用[10]。

疲劳是由于运动引起机体生化改变，从而降低了肌肉力量。评价疲劳的方法有耐力实验和生化指标检测，小鼠负重力竭游泳时间是评定抗疲劳特性中最常用的指标，是体能的综合表现[11]，本实验中小鼠服用蛤蚧各炮制品均没有延长小鼠负重游泳的时间。影响小鼠游泳时间的因素很多，如小鼠游泳难以保证其具有相同的运动节奏，部分小鼠在刚下水后极力挣扎，运动速度快且激烈，易缩短游泳时间。因此不能凭单项实验数据而否认蛤蚧不同炮制品的抗疲劳作用，需综合考量才能判定蛤蚧不同炮制品是否具有抗疲劳作用。

剧烈运动时，机体相对缺氧，可加快糖酵解，产生大量乳酸，使H+浓度上升、pH值下降，导致机体疲劳[12]。乳酸在体内的积聚取决于乳酸的产生与消除速度，减少乳酸的产生或加快乳酸的消除速度，都可延缓疲劳发生或加快疲劳的消除。能源耗竭是疲劳产生的重要原因之一，糖原作为机体中的重要能源物质可以反映疲劳发生的快慢和程度[13]。分析本实验研究结果，可知小鼠连续服用21 d蛤蚧不同炮制品后，能够显著降低血清乳酸的含量，升高肝糖原含量，表明蛤蚧各炮制品均具有缓解疲劳的作用，但各炮制品组与蛤蚧组的区别不大。

血清尿素氮含量可以反映机体肌肉蛋白质的分解和合成代谢情况，可以用于分析与评价机体在大强度运动条件下体力负荷承受能力的状况[14]。机体长时间不能通过糖、脂肪分解代谢得到能量，加快蛋白质与氨基酸分解代谢速度，使血中尿素氮含量增加[15]。本实验研究结果显示，小鼠在大强度耐力运动游泳后，服用蛤蚧、油酥制蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的小鼠血清尿素氮含量与空白组比较无统计学差异，服用酒蛤蚧组的小鼠血清尿素氮含量高于空白组。推测原因可能为蛤蚧是富含蛋白质类的药物，小鼠长期服用可能会造成运动后血清尿素氮的含量增加。

综上所述，服用蛤蚧不同炮制品能减少运动后血清中的乳素堆积量、提高肝糖原含量，蛤蚧不同炮制品在一定程度上具有缓解疲劳的作用。酒蛤蚧、油酥蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的抗疲劳作用与蛤蚧有一定区别，但作用差异不大。寻求蛤蚧不同炮制品的药效作用差别还需多模型、多指标进一步研究。