杜仲黑茶中氨基酸和矿物元素分析及对“三高症”的影响

穆文碧，张建永，李明丹，曾宏亮，段灿灿，谢友旺

(1.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099；2.湖南省药物安全评价研究中心，湖南 长沙 410208；3.湖南省中医研究院，湖南 长沙 410013；4.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；5.张家界茶坤缘杜仲生物科技开发有限公司，湖南 张家界 427200)

随着社会的发展，心脑血管病已成为我国重大卫生问题，时刻威胁着人类健康，而“三高症”是其发病的重大危险因素。“三高症”即指高血压、高血糖及高脂血症，由现代社会派生的“富贵病”，被称为人类致命的“头号杀手”[1-2]。其中高血压可引起脑出血和脑血管破裂，高血糖能引起糖尿病，高血脂会导致血管栓塞等，为减少心脑血管病的发生，积极防治高血压、高血糖、高脂血症已刻不容缓[3]。杜仲黑茶属黑茶类，因采用传统名贵滋补药材杜仲树的嫩叶做茶而得名，主料包括杜仲叶、绞股蓝及黑茶茶叶，并辅以蜂蜜、甘草、红枣、营养水和木糖醇制作而成[4]。作为主料的杜仲叶是杜仲科杜仲属植物(Eucommiaulmoides)[5]的叶子，活性成分有黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类、木脂素类及多糖类等，主要药理作用为降血压、降血脂、降血糖、强筋健骨、抗衰老等[6]。杜仲叶对高血压、高血糖及高脂血症具有良好的治疗作用，然由杜仲叶深加工而成的杜仲黑茶是否有相同药理活性与作用效果尚不明确。基于此，本文将分别建立高血压、高血糖、高脂血症的大鼠模型，观察实验大鼠血压、血糖和血脂的水平，探究杜仲黑茶辅助降低“三高症”的功效。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料 杜仲黑茶(批号：20190401，张家界茶坤缘杜仲生物科技开发有限公司)，杜仲平压片(批号：180101，湖南安邦制药有限公司)。盐酸二甲双胍片(批号：11712225，浙江亚太药业股份有限公司)，葡萄糖(批号：20180606，国药集团化学试剂有限公司)，地塞米松磷酸钠注射液(批号：180901，三名三兽药有限公司)，注射用生理盐水(批号：18012001D，湖南康源制药有限公司)。辛伐他汀片(批号：180605，天津怀仁制药有限公司)，脂降宁片(批号：180902，通化金恺威药业有限公司)。

实验动物：128只4周龄的SPF级雄性SD大鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，体重190～220 g(生产许可证号：SCXK[湘]2016-0002，质量合格证号：No.43004700058859)。

高脂饲料配方：每100 kg高脂饲料含维持鼠料粉料43.7 kg、蔗糖20.0 kg、猪油10.0 kg、酪蛋白(85%)12.5 kg、胆固醇1.2 kg、磷酸氢钙1.3 kg、石粉0.5 kg、胆酸钠0.2 kg。购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(生产许可证号：SCXK[湘]2014-0002，合格证编号：No.43200600006 023)。

1.1.2 仪器 PL2002型电子天平(梅特勒-托利多仪器[上海]有限公司)；MS105DU型分析天平(湖南省药物安全评价研究中心编号：362，梅特勒-托利多中国有限公司)；BP-6A型自动无创血压测量系统(湖南省药物安全评价研究中心编号：149，成都泰盟实验科技有限公司)；血糖测试仪(湖南省药物安全评价研究中心编号：548，艾康生物技术[杭州]有限公司)；LABOSPECT003型自动生化分析仪(湖南省药物安全评价研究中心编号：001，日本日立)。

1.2 杜仲黑茶水溶液的制备 称取l kg杜仲黑茶，以10 L煮沸纯化水浸泡提取30 min后过滤，提取2次，合并滤液，60 ℃浓缩至5 L(终浓度为0.2 g/mL)，混匀密封存于-80 ℃冰箱备用。

1.3 杜仲黑茶中氨基酸和矿物元素的检测 取杜仲黑茶适量，参考GB5009.124-2016标准方法，检测杜仲黑茶中的氨基酸含量；按照国家标准GB/T5009.57-2003相关规定，检测杜仲黑茶中矿物元素的种类和含量。

1.4 杜仲黑茶对“三高症”的影响

1.4.1 杜仲黑茶对肾血管型高血压大鼠的影响 参考文献报道[7]，采用两肾一夹法制备肾血管型高血压(简称肾性高血压)大鼠模型，将40只SPF级雄性大鼠(190～220 g)分为空白(8只)和模型组(32只)，空白组做假性手术，模型组选用内径为0.20～0.25 mm的银夹置于左肾动脉尽量靠近主动脉处，30 d后采用BP-6A型自动无创血压控制器测量大鼠尾动脉的收缩血压，若收缩血压≥21.3 kPa(160 mmHg)且较稳定，或血压较术前高4 kPa即表明模型建立成功[8]。再将32只模型大鼠分为模型、阳性对照以及杜仲黑茶高、低剂量共4组(n=8)。空白和模型组ig等体积蒸馏水，阳性对照组ig杜仲平压片水溶液0.8 mg/(kg·d)，杜仲黑茶高、低剂量组ig杜仲黑茶水溶液2.0、0.5 g/(kg·d)，给药时间为28 d。

1.4.2 杜仲黑茶对高血糖大鼠的影响 参照保健食品规范方法[9]，SPF级雄性大鼠(190～220 g)40只维持饲料适应1周后，禁食4 h，取尾血测定给葡萄糖前(0 h)血糖值即空腹血糖，给予葡萄糖(2.5 g/kg)后测定30、120 min血糖值，作为该批动物基础值。将大鼠随机分为5组(n=8)，即空白、模型、阳性对照组以及杜仲高、低剂量组。空白组全程给予维持饲料；模型及给药组给予维持饲料1周后换为高脂饲料，饲喂2周后在高脂饲喂基础上联合腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液10 mL/(kg·d)，连续10 d。其中空白和模型组大鼠ig等体积蒸馏水，阳性对照组ig盐酸二甲双胍片水溶液0.11 g/(kg·d)，杜仲黑茶高、低剂量组ig杜仲黑茶水溶液2.0、0.5 g/(kg·d)，连续给药35 d。试验结束，各组动物禁食4 h，检测空腹血糖及糖耐量水平。

空腹血糖、糖耐量实验：各组大鼠禁食4 h，测定给葡萄糖前(0 h)血糖值即空腹血糖；给药组给予相应药物，模型组给予等体积蒸馏水，空白组不做处理，20 min后各组 ig葡萄糖(2.5 g/kg)，并测定30、120 min的血糖值。若模型组30 min血糖值≥10 mmol/L，或30、120 min任一时间点血糖值或血糖曲线下面积显著性升高，可判定糖代谢紊乱模型成立，在此基础上，观察模型组与给药组空腹血糖、给葡萄糖后(30、120 min)血糖及0、30、120 min血糖曲线下面积的变化。血糖曲线下面积AUC =1/2×(0 min血糖值+30 min血糖值)×0.5+1/2×(120 min血糖值+30 min血糖值)×1.5。以OGM-111型血糖测试仪对大鼠的血糖值进行测定，正常大鼠降糖试验：给药组空腹血糖对比空白组无统计学意义，即判定对正常大鼠血糖无影响。高血糖模型降糖试验：模型成立前提下，对比模型组，给药组空腹血糖下降或血糖值下降有统计学意义，判定该药物空腹血糖指标结果阳性；糖耐量指标：模型成立前提下，对比模型组，给药组在给葡萄糖后30、120 min任一时间点血糖下降有统计学意义，或0、30、120 min血糖曲线下面积降低有统计学意义，判定该药物糖耐量指标结果阳性。空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性[8-9]。

1.4.3 杜仲黑茶对高脂血症大鼠的影响 参照保健食品辅助降血脂动物试验混合型高血脂造模方法[10]，48只SPF级雄性大鼠(190～220 g)，先分为空白组(8只)和模型组(40只)，空白组大鼠给予维持饲料，模型组大鼠给予高脂饲料。饲喂10 d后，大鼠不禁食眼内眦采血，按照相应试剂盒说明书进行操作，采用LABOSPECT003型自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。对比空白组，模型组血清甘油三酯TG升高，血清总胆固醇TC或低密度脂蛋白胆固醇LDL-C升高，差异均有显著性，即可判定模型成立[8,10]。根据血清TC水平将模型组大鼠分为模型、阳性对照1、阳性对照2以及杜仲黑茶高、低剂量共5组(n=8)。空白和模型组ig等体积蒸馏水，阳性对照组1 ig辛伐他汀片水溶液3.6 mg/(kg·d)，阳性对照2 ig脂降宁片水溶液0.81 mg/(kg·d)，杜仲黑茶高、低剂量组ig杜仲黑茶水溶液2.0、0.5 g/(kg·d)，给药期间空白组给予维持饲料，模型及给药组给予高脂饲料，药程共30 d。

2 结果

2.1 杜仲黑茶中氨基酸及矿物元素分析 杜仲黑茶氨基酸检测发现其含有16种氨基酸，其中包括甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及苏氨酸8种人体必需氨基酸(见表1)。矿物元素检测可知杜仲黑茶仅含铁、钾等共19种矿物元素(见表2)。

表1 杜仲黑茶中氨基酸的检测

表2 杜仲黑茶中矿物元素的检测

2.2 杜仲黑茶辅助降血压的结果 杜仲黑茶对肾性高血压大鼠的影响：对比空白组，模型组大鼠血压显著升高(P=0.000)，提示高血压大鼠模型建造成功；药物干预后，对比模型组，阳性对照组的血压明显降低(P=0.000)，杜仲黑茶的高、低两个剂量组的血压显著降低(P=0.002、P=0.032)，且作用效果与阳性药相当(见表3)。

表3 杜仲黑茶对肾性高血压大鼠的影响

2.3 杜仲黑茶辅助降血糖的结果 杜仲黑茶对大鼠血糖的影响：给药后，与空白组比较，模型组大鼠血糖值明显升高，具有统计学差异(P=0.000)，且血糖曲线下面积AUC显著增加(P=0.000)，提示高血糖模型成立；与模型组比较，阳性对照组血糖值及血糖曲线下面积显著降低(P=0.004)，杜仲黑茶低剂量组大鼠在0、30、120 min血糖值具有明显降低(P=0.047)，且杜仲黑茶高、低剂量组大鼠的血糖曲线下面积AUC明显降低(P=0.042、P=0.036，见表4)。

表4 大鼠各时间点的血糖值

2.4 杜仲黑茶辅助降低高脂血症的作用 杜仲黑茶对高血脂大鼠的作用：对比空白组，模型组TG、TC、LDL-C显著升高(P=0.000、P=0.003、P=0.005)，表明高血脂大鼠模型建造成功；药物干预后，对比模型组，辛伐他汀片组TG、LDL-C显著降低(P=0.000、P=0.036)，脂降宁片组TG明显降低(P=0.001)，杜仲黑茶低剂量组TG显著下降(P=0.000)，杜仲黑茶高剂量组TG、TC均明显降低(P=0.000、P=0.047)，杜仲黑茶2个剂量组对高血脂均有不同程度的改善，且作用不亚于其他2个阳性对照药(见图1)。

A-C：分别是药物对大鼠总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的影响；Control：空白组，Model：模型组，DZ-L：杜仲黑茶低剂量组，DZ-H：杜仲黑茶高剂量组，XFTD：辛伐他汀片，ZJN：脂降宁片；**：与空白组相比，P<0.01；#：与模型组相比，P<0.05；##：与模型组相比，P<0.01。

3 讨论

杜仲黑茶属黑茶类，因采用杜仲叶做茶而得名，其主要成分包括杜仲叶、绞股蓝及黑茶茶叶。其中杜仲叶活性成分丰富，药理作用突出，具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化及抗疲劳等多种功效，《中国药典》 2015版将其收录[11]。然而由杜仲叶加工而成的杜仲黑茶是否具有相同的药理作用尚不可知，因此，本研究对杜仲黑茶中营养成分进行了初步分析并研究了其对三高症的影响。

氨基酸成分测定结果显示，杜仲黑茶中富含16种氨基酸，这些氨基酸具有维持机体生理功能作用，缺少任何一种都可能导致机体代谢紊乱、免疫力降低等[12]。同时还包括锌、铜等19种微量元素，微量元素的摄入量及其平衡影响着人体的健康[13]。杜仲黑茶的谷氨酸、天冬氨酸精氨酸等氨基酸的含量比湖北名优绿茶的高[14]；杜仲黑茶中铁和锰元素的含量明显高于梵净山藤茶、红茶、黑茶，然其钙、镁、钠等元素含量却不及梵净山黑茶[15]。

杜仲黑茶对肾性高血压大鼠影响的实验结果显示，杜仲黑茶对肾性高血压大鼠表现出明显的降压作用，且功效与降压药杜仲平压片相当。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[8]，可判定杜仲黑茶辅助降血压功能的大鼠实验结果阳性。此外，本研究结果与既往报道的杜仲叶提取物可显著改善自发性高血压和肾性高血压模型大鼠的高血压[16]一致，即提示杜仲黑茶具有辅助降血压的功效。杜仲黑茶降低高血糖大鼠血糖值的实验结果表明，杜仲黑茶对正常大鼠的血糖无明显影响，但是能够显著改善高血糖大鼠的血糖值及血糖曲线下面积，按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[8]和国家食品药品监督管理局《关于印发抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法的通知》(国食药监保化[2012]107号[9]，可判定杜仲黑茶辅助降低血糖功能的实验结果阳性。同时，本研究与张红霞等[17]发现杜仲叶醇提物通过抑制葡萄糖吸收降低血糖的结果一致；邢冬杰等[18]的研究表明糖尿病大鼠的血糖值可被杜仲叶黄酮显著降低；高燕等[19]的研究也表明高血糖的绵羊可通过给予杜仲叶后，提高糖酵解、促进肝糖原合成从而降低其血糖值，综上可知杜仲黑茶具有一定的辅助降低高血压的功效。杜仲黑茶对高脂血症大鼠实验结果表明，杜仲黑茶对高脂血症大鼠的血清总胆固醇、甘油三酯水平具有明显的改善作用，且治疗效果与辛伐他汀片和脂降宁片两种降脂药相当，按照国家食品药品监督管理局《关于印发抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法的通知》(国食药监保化[2012]107号)[10]及《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的要求进行分析[8]，可判定杜仲黑茶辅助降低血脂功能大鼠实验结果阳性。此外，雷燕妮等[20-21]、刘静等[22]的研究结果均显示杜仲叶具有降脂活性一致，由此可知杜仲黑茶具有一定的辅助降低高血脂的功效。

综上所述，本研究发现杜仲黑茶富含16种氨基酸和19种矿物元素，如锌、铜、铁等微量元素，大鼠实验结果表明，杜仲黑茶有辅助降低血压、血糖及血脂的功效。杜仲黑茶具有辅助降低高血压、高血糖和高血脂的功效，有望为抑制和减少三高症提供新的预防、保健和治疗策略。但是杜仲黑茶降三高的作用机制还不清楚仍有待进一步的研究。