“脑-肠轴”学说研究益生菌联合肠内营养对脑梗死大鼠免疫及认知功能的影响

王燕 石剑 贡丽雅 王凤姣

(河北医科大学第二医院营养科，河北 石家庄 050000)

脑梗死具有高发病率、高致残率、高致死率的特点，是导致人类死亡的主要原因之一〔1〕，近年来，其发病率不断提高，且呈现出明显的年轻化趋势，严重威胁人类身心健康〔2〕。脑梗死患者神经功能受损严重，常因意识不清而不能自主进食，引起不同程度的营养不良及免疫功能低下，还经常伴随肠道菌群失调、胃肠功能紊乱、肠黏膜屏障受损等并发症，影响其预后〔3〕。“脑-肠轴”是肠道菌群与大脑之间的双向通信系统，脑梗死患者即可通过脑-肠轴之间的神经、激素和免疫信号而影响肠道菌群的组成及代谢，进而影响胃肠功能造成各种并发症〔4〕，而肠道菌群与大脑之间是双向的调节关系〔5〕，因此通过影响肠功能修复脑梗死患者脑损伤是临床研究的热点。研究表明，脑梗死患者进行早期肠内营养支持，可维持患者营养支持，改善患者肠道功能紊乱和便秘症状，促进肠黏膜免疫系统细胞代谢和组织功能恢复，提高机体免疫功能，改善机体氧化应激状态，提高抗感染能力，进而减轻脑损伤，改善神经功能缺损症状〔6,7〕；益生菌主要是常见的乳酸杆菌及双歧杆菌，属于人体肠道正常菌群的优势菌，应用益生菌治疗可以抑制条件致病菌过度生长，有效维持肠道菌群平衡，并保护肠黏膜屏障〔8〕，并可有效提高机体免疫力〔9〕。但益生菌联合肠内营养对脑梗死大鼠肠黏膜屏障、免疫及认知功能的影响目前还不清楚，本文通过建立脑缺血再灌注大鼠模型，对其进行初步研究。

1 材料与方法

1.1动物 SD雄性大鼠〔许可证号：SCXK(粤)2013-0034，广东中医药大学动物实验中心〕，SPF清洁级，体重200～240 g，在清洁安静的环境中饲养，自然光照，温度保持在约25℃，湿度约为50%，噪音不高于80 dB，每小时保持通风换气约10次，定期清理鼠笼，消毒，更换垫料、饲料、饮水。

1.2主要试剂及仪器 双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(蒙古双奇药业公司生产，国药准字为 S19980004)；肠内营养混悬液〔纽迪希亚制药(无锡)有限公司生产，国药准字为H20030011〕；脂肪乳氨基酸(17)葡萄糖(11%)注射液(Fresenius Kabi AB生产，国药准字为J20040090)；DAO检测试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司生产，货号为JK-(a)-2773)；D-乳酸检测试剂盒〔孟成科技(上海)有限公司生产，货号为K667〕；大鼠CD4+-PE(上海恒斐生物科技有限公司生产，货号为201507-1)；大鼠CD8+-FITC(武汉博欧特生物科技有限公司生产，货号为orb248785)；大鼠IgG ELISA试剂盒(美国Abcam公司生产，货号为ab189578)；大鼠IgM酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Abcam公司生产，货号为ab215085)等。XR-XC105型Morris水迷宫视频分析系统(上海欣软信息科技有限公司)；CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)；Centrifuge 5424R低温高速离心机(德国Eppendorf股份公司)；制冰机、恒温水浴锅(北京六一仪器厂)等。

1.3动物模型制备及分组给药 参考文献〔10〕，将SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉，以仰卧位固定在鼠板上，颈部备皮后以75%酒精消毒，在正中做约2 cm的纵向切口，分离暴露左侧颈总动脉(CCA)，在血管外预置缝线备用，沿CCA 向上继续分离暴露颈外动脉(ECA)，以缝线结扎CCA及ECA近心端，以动脉夹夹闭CCA 远心端，在距CCA分叉部4 mm处剪一小口，插入0.24 mm的线栓后用缝线打一活结，取下动脉夹，稍提ECA继续缓慢插入线栓至感觉到阻力阻塞血管，扎紧CCA远心端的缝线，拴线尾端部分暴露于外，1.5 h后将栓线抽出，即完成缺血模型制备，根据大鼠活动情况，以Longa分级法〔11〕对造模后大鼠的神经功能缺损进行评分，标准：无神经功能缺损0分、不能完全伸展对侧前爪1分、行走向对侧转圈2分、行走向对侧倾倒3分、意识丧失，不能自发行走4分、死亡5分。评分1～3分为成功的大鼠模型〔12〕，共成功48只，将其随机分为模型组、益生菌组、肠内营养组、益生菌+肠内营养组，每组12只。另取12只大鼠仅麻醉后只暴露、分离CCA、ECA后缝合处理，作为假手术组。

各组大鼠均做空肠置管造瘘术：在幽门处插入直径约1.0 mm的无菌硅胶管，远端到达屈氏韧带以下5 cm处固定，由皮下隧道至颈背部肩胛间引出，各组大鼠均在首次用药前以微量输液泵推注2 ml生理盐水冲洗肠管。参照文献进行人鼠剂量换算，双歧杆菌乳杆菌三联活菌片，研磨后加入20 ml水中，以微量输液泵经肠管注入大鼠体内，每天300 mg/kg〔13〕，肠内营养液每天以微量输液泵经肠管注入大鼠体内35 ml，使总热量为35 kCal，每次推注5 ml，每天推注7次，两次推注的时间间隔为2 h〔14〕，假手术组、模型组、益生菌组每天以微量输液泵经肠管注入脂肪乳氨基酸(17%)葡萄糖(11%)注射液48 ml，使总热量保持为35 kCal，持续治疗14 d。

1.4标本收集及大鼠肠黏膜屏障检测 各组大鼠经尾静脉取血5 ml，取出1 ml备用，其余4 ml静置15 min，3 000 r/min，4℃离心15 min，取上清即血清备用。二胺氧化酶(DAO)是小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，其活性与黏膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，可反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度，D-乳酸是肠道内细菌产生的，当肠黏膜受损时，会进入血液，可及时反映肠黏膜受损程度和通透性，故检测血清中DAO、D-乳酸水平，可反映肠黏膜屏障完整性及功能〔15〕。

取收集的血清500 μl分别用DAO、D-乳酸检测试剂盒检测血清中DAO、D-乳酸水平，操作步骤参照说明书进行。

1.5大鼠免疫功能检测1.4中的血清500 μl分别用ELISA试剂盒检测血清中IgG、IgM含量，操作步骤参照说明书进行。1.4中的血液以红细胞裂解液在冰浴下裂解30 min，1 000 r/min，4℃离心5 min，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞沉淀后计数，取约含有1×106个细胞的细胞液，加入大鼠PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8单克隆抗体后振荡混匀，4℃，避光孵育40 min，1 000 r/min，4℃离心5 min，PBS洗涤细胞沉淀，加入0.5 ml PBS重悬后混匀，采用流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4+和CD8+百分比，并计算其比值。

1.6大鼠神经功能缺损情况检测 大鼠末次给药结束24 h后，观察各组大鼠活动情况，以Longa分级法〔11〕对其神经功能缺损情况进行评分。

1.7大鼠认知功能检测 大鼠末次给药结束24 h后，以Morris水迷宫实验检测各组大鼠认知功能，参照文献〔16〕：准备一个Morris直径160 cm、高 50 cm的水迷宫水池，将其分为4个象限，并在每个象限水池壁的正中分别固定4个不同形状的标记作为参照物，向水池中注水，水温保持22～26℃，水深22 cm，在第三象限正中放置直径12 cm，高20 cm的平台。在实验开始前1 d将大鼠放入水池中进行适应训练，实验共进行6 d，前5 d为定位航行实验，将大鼠面朝池壁的标记从第一至第四象限放入水中，记录大鼠找到水下平台的时间，即为平均逃避潜伏期；第6天为空间探索实验，撤去平台，将大鼠面朝池壁的标记从第一象限放入水中，记录其在1 min内穿越平台原位置的次数，以用来评估大鼠空间学习和记忆能力。

1.8统计学分析 采用SPSS24.0软件进行方差分析，t检验。

2 结 果

2.1各组肠黏膜屏障功能比较

2.1.1各组血浆中DAO、D-乳酸水平比较 与假手术相比，模型组DAO、D-乳酸的水平均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，益生菌组、肠内营养组、益生菌+肠内营养组DAO、D-乳酸的水平均明显降低(P<0.05)；与益生菌组、肠内营养组相比，益生菌+肠内营养组DAO、D-乳酸的水平均明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组血浆中DAO、D-乳酸水平比较

2.2各组免疫功能比较

2.2.1各组血清中IgG、IgM含量比较 与假手术组相比，模型组IgG、IgM含量均明显降低(P<0.05)；与模型组相比，益生菌组、肠内营养组、益生菌+肠内营养组IgG、IgM含量均明显升高(P<0.05)；与益生菌组、肠内营养组相比，益生菌+肠内营养组IgG、IgM含量均明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组血清中IgG、IgM含量比较

2.2.2各组血清中T淋巴细胞CD4+/CD8+比较 与假手术组(2.15±0.25)相比，模型组CD4+/CD8+明显降低(1.48±0.16，P<0.05)；与模型组相比，益生菌组(1.77±0.19)、肠内营养组(1.79±0.20)、益生菌+肠内营养组(2.05±0.24)CD4+/CD8+均明显升高(P<0.05)；与益生菌组、肠内营养组相比，益生菌+肠内营养组CD4+/CD8+均明显升高(P<0.05)，见图1。

图1 各组血清中T淋巴细胞CD4+、CD8+比例

2.3各组认知功能比较

2.3.1各组神经功能缺损评分比较 与假手术组〔(0.00±0.000)分〕相比，模型组神经功能缺损评分明显升高〔(2.81±0.27)分，P<0.05〕；与模型组相比，益生菌组〔(1.96±0.19)分〕、肠内营养组〔(1.93±0.26)分〕、益生菌+肠内营养组〔(0.98±0.16)分〕神经功能缺损评分均明显降低(均P<0.05)；与益生菌组、肠内营养组相比，益生菌+肠内营养组神经功能缺损评分均明显降低(P<0.05)。

2.3.2各组水迷宫实验结果比较 与假手术组(6.80±1.20)相比，模型组水迷宫实验从第3天起平均逃避潜伏期明显升高(P<0.05)，穿越原平台位置次数明显降低(P<0.05)；与模型组相比，益生菌组、肠内营养组、益生菌+肠内营养组水迷宫实验从第3天起平均逃避潜伏期明显降低(P<0.05)，穿越原平台位置次数升高(P<0.05)；与益生菌组、肠内营养组相比，益生菌+肠内营养组大鼠水迷宫实验从第3天起平均逃避潜伏期明显降低(P<0.05)，穿越原平台位置次数明显升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组平均逃避潜伏期、大鼠穿越原始位置次数比较

3 讨 论

脑-肠轴是脑和肠道之间由神经、激素和免疫信号组成并相互影响的通信系统，通过该通信系统，机体大脑和肠道之间可相互影响，即神经系统可通过脑-肠轴影响肠道微生物的组成及数量，介导肠道免疫及吸收功能；肠道微生物群及其代谢物也可通过脑-肠轴调节神经系统功能，影响神经系统相关疾病的发病进程，因为肠道微生物在其中起到关键作用，故又称为微生物-脑-肠轴〔17〕。脑梗死会影响患者肠道菌群组成，使致病菌增多，有益菌下降，损伤肠黏膜屏障，肠内营养治疗可纠正肠道菌群组成，修复肠黏膜结构，提高免疫功能〔18〕。益生菌是胃肠道的共生菌，可恢复肠道菌群正常组成，修复肠道屏障功能，并通过调节肠道细胞免疫反应提供机体免疫力〔19〕。对重度颅脑损伤患者的治疗中，益生菌联合肠内营养可有效调整肠道菌群，改善患者的营养状况，降低菌群失调、肺部感染和腹泻的发生率〔20〕，根据“脑-肠轴”学说，益生菌联合肠内营养预计可提高脑梗死患者免疫力，修复肠黏膜屏障，提高患者认知功能。本研究结果表明脑梗死大鼠肠黏膜屏障明显受损，免疫力降低，神经功能受损，认知能力下降。揭示脑梗死大鼠会因脑损伤引起肠肠黏膜屏障及免疫功能受损，和“脑-肠轴”学说理论相符。本研究结果表明益生菌、肠内营养治疗均可修复大鼠肠黏膜屏障，恢复受损神经功能，提高免疫力及认知能力，两者联合应用具有协同作用，比单独应用效果好，揭示益生菌联合肠内营养对治疗脑梗死具有良好的效果，为脑卒中的临床治疗提供了新的思路。