雌激素受体α基因多态性与绝经后糖尿病肾病中医证型的关系

白牧鑫 韩林露 徐梅昌 杨蕾 邓旭 王俊 刘善军

(1南京中医药大学附属南京市中西医结合医院肾内科，江苏 南京 210014；2济宁医学院附属医院中医科)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管病变最严重的一种并发症，是造成慢性肾脏疾病和终末期肾病(ESRD)的重要原因〔1〕。DN是导致我国糖尿病患者死亡的主要原因〔2〕。DN的具体发病机制目前还不清楚，但环境和遗传因素在其发病中发挥着重要作用。研究显示，男性患者较女性患者更易出现DN,并发展到ESRD〔3〕。然而，在DN引起的ESRD中,绝经后女性患者的比例显著升高〔4〕。研究表明，雌激素与DN的发病机制有关〔5〕。雌激素的作用主要受两种已知的雌激素受体(ESR)——ESRα(ESR1)和ESRβ(ESR2)调控〔6〕，而ESR1介导大部分的生物学效应〔7〕。雌激素可以通过ESR1上调内皮一氧化氮合酶mRNA的表达，增加其蛋白质表达水平，加速一氧化氮(NO)的释放，从而改善NO引起的肾脏损伤〔8〕。研究表明，ESR1基因位点PvuⅡ(rs2234693，C>T)和XbaⅠ(rs9340799，A>G)的多态性与2型糖尿病(T2DM)的发病机制有关〔9〕，而目前还没有关于ESR1基因多态性与DN相关性的报道。中医证型是指在疾病的进展过程中，患者个体于某个阶段及当时所处特定内环境的本质反映〔10〕。探讨DN的中医证型与基因多态性的相关性，有利于探究DN的发病机制的和进一步提高DN的中医辨证论治水平。因此，本研究拟探讨绝经后女性DN患者中医证型与ESR1基因多态性及实验室指标之间的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 选择2014年1月至2018年12月在南京中医药大学附属南京市中西医结合医院和济宁医学院附属医院就诊的148例绝经后女性2型DN患者为DN组，平均年龄(58.39±7.42)岁。纳入标准为：(1)符合我国T2DM防治指南(2007年版)中DN的诊断标准；(2)符合DN的中医诊断和辨证分型标准；(3)年龄18～70岁；(4)未进行肾透析。排除标准为：(1)严重心血管、肝脏疾病或合并其他严重原发性疾病的患者；(2)合并感染或发热患者。参照《中药新药临床研究指导原则》，结合DN患者的症状体征及舌象脉象，进行中医辨证分型，分为阴虚热盛证、气阴两虚证和阴阳两虚证。此外，纳入120例绝经后女性健康体检者为对照组，平均年龄(60.24±6.36)岁。参与者均签署知情同意书。

1.2观察指标及方法

1.2.1一般人口学特征 记录所有研究对象的年龄及绝经时年龄。

1.2.2实验室相关指标 采集DN患者空腹静脉血3 ml，以3 600 r/min离心5 min后，分离血清，保存于-20℃条件下。应用全自动生化仪(日本奥林巴斯)检测血清肌酐(Scr)、血清胱抑素(Cys)C、尿酸(UA)。使用高效液相自动测定仪(美国伯乐公司)测定糖化血红蛋白(HbA1c)。留取晨尿，采用肌酐酶法测定尿肌酐(U-Cr)，采用散射比浊法测定尿微量白蛋白(m-Alb)。计算m-Alb与U-Cr的比值(ACR)。

1.3外周血DNA的提取及基因型检测 抽取两组患者静脉血2 ml,乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝，按照QIAGENFlexiGene DNA试剂盒操作步骤提取DNA，采用Nanodrop2000测定DNA浓度，-20℃保存。根据ESR1基因的两个 SNP 位点：PvuⅡ(rs2234693,C>T)和 XbaⅠ(rs9340799,A>G)，结合引物设计原则，设计两个SNP位点的上下游引物分别为：PvuⅡ(rs2234693,C>T)上游引物为5′-ACATGTTCTGTTGTCCATC-3′，下游引物为5′-CCAACTCTAGACCACACTCAGG-3′，扩增产物长度102 bp，XbaⅠ(rs9340799,A>G)的上游引物为5′-CATCTGAGTTCCAAATGTCCC-3′，下游引物为5′-TTTCAGAACCATTAGAGACCAATG-3′，扩增产物长度107 bp。反应采用三步法聚合酶链反应(PCR)扩增，优化后的反应体系条件是：95℃预变性2 min，1个循环；95℃变性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，扩增40个循环。PCR扩增产物用4%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.4统计学分析 采用SPSS23.0软件进行χ2检验、Hardy-Weinberg平衡定律(HWE)检验、方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1基因分布情况 对照组的PvuⅡ和XbaⅠ位点的基因型分布均遵循Hardy-Weinberg平衡法则(PHWE>0.05)。基因分型结果表明，DN组和对照组的PvuⅡ位点的基因型和等位基因分布均有统计学差异(P<0.01)；对于XbaⅠ位点，基因型在两组的分布无显著差异(P>0.05)，而等位基因的分布两组间差异显著(P<0.05)，见表1。

表1 ESR1基因PvuⅡ(rs2234693)和XbaⅠ(rs9340799)的基因型及等位基因分布〔n(%)〕

2.2不同中医证型的DN患者ESR1基因型及等位基因分布情况 中医辨证分型结果显示，阴虚热盛证39例(26.4%)，气阴两虚证64例(43.2%)，阴阳两虚证45例(30.4%)。对于ESR1基因PvuⅡ位点，3种不同证型的DN患者的基因型及等位基因分布均有统计学差异(P<0.001)。阴虚热盛证和气阴两虚证患者的基因型分布频率均为CT>CC>TT；阴阳两虚证患者的基因型分布频率为TT>CT>CC。PvuⅡ位点野生型等位基因T在3种证型中的分布频率为阴阳两虚证>阴虚热盛证>气阴两虚证，见表2。对于XbaⅠ位点，不同证型的DN患者基因型及等位基因分布的差异也均有统计学意义(P<0.01)。阴虚热盛证和阴阳两虚证患者的基因型分布频率均为AA>AG>GG；气阴两虚证患者的基因型分布频率为AG>AA>GG。XbaⅠ位点野生型等位基因G在3种证型中的分布频率为气阴两虚证>阴虚热盛证>阴阳两虚证，见表3。

表2 不同中医证型DN患者ESR1基因PvuⅡ(rs2234693)基因型及等位基因分布〔n(%)〕

表3 不同中医证型DN患者ESR1基因XbaⅠ(rs9340799)基因型及等位基因分布〔n(%)〕

2.3不同中医证型DN患者的实验室指标 HbA1c在3种证型之间无显著性差异(P>0.05)；而Scr、CysC、尿ACR及UA在3种证型的患者中两两比较均有统计学差异(P<0.05)，且随阴虚热盛、气阴两虚及阴阳两虚呈现显著升高趋势。见表4。

表4 不同中医证型DN患者的实验室指标的比较

2.4不同中医证型DN患者ESR1基因型和实验室指标的相关性 对于ESR1基因的PvuⅡ位点，在阴虚热盛证和气阴两虚证中，相比于携带野生型CC者，T等位基因(CT+TT)携带者的ACR水平显著增高(P<0.05),而其他指标在不同基因型中差异无显著性(P>0.05)；在阴阳两虚证中，T等位基因(CT+TT)患者Scr、CysC、ACR和UA水平都显著高于CC基因型患者(P<0.05)，见表5。对于ESR1基因的XbaⅠ位点,在阴虚热盛证中，携带野生型AA者和G等位基因(AG和GG)者相比，所有实验室指标均无统计学差异(P>0.05)；在气阴两虚证中，携带AG和GG基因型者CysC显著高于AA基因型患者(P<0.05)，而两组其他实验室指标无统计学差异(P>0.05)；在阴阳两虚证中，携带G等位基因者与AA基因型相比，Scr显著增高(P<0.05)，而其他实验室指标与基因型无关(P>0.05)，见表6。

表5 不同中医证型DN患者的Pvu Ⅱ基因型与实验室指标的相关性分析(x)

表6 不同中医证型DN患者的XbaⅠ基因型与实验室指标的相关性分析

3 讨 论

很多学者认为，DN基本按照阴虚热盛——气阴两虚——阴阳两虚的规律动态演变〔11,12〕。其中气阴两虚阶段持续时间较长，是并发症加重的病理基础,是影响疾病转归的枢机和防治的关键〔13〕。本研究与之前的研究一致〔14〕，说明气阴两虚证可能是DN的主要病机。

ESR是一种蛋白质分子，在靶细胞内可以与雌激素特异性结合形成激素-受体复合物，使雌激素发挥复杂的生物学作用。ESR包括ESR1和ESR2，而雌激素发挥的大部分效应由ESR1介导，雌激素水平升高对DN具有保护作用。雌激素与ESR1结合可以降低血管紧张素2和内皮素的合成，从而抑制肾脏血管收缩及降低肾脏的炎症反应〔15〕。此外，雌激素可以通过激活MAPK/AP-2信号通路促进基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达和刺激MMP-9的合成，从而降低内皮细胞纤维化水平，改善DN〔16〕。人类的ESR1基因位于染色体6q24～27区带，长度为140 kb，由8个外显子和7个内含子组成，而第1内含子中的PvuⅡ(rs2234693)和XbaⅠ(rs9340799)是ESR1基因研究最广泛的两个位点〔6〕。研究已经证实PvuⅡ和XbaⅠ位点多态性可以影响ESR1的mRNA表达，从而引起蛋白质表达水平的改变〔17,18〕。一项meta分析〔9〕结果显示，ESR1基因的PvuⅡ和XbaⅠ多态性与T2DM的发病机制有关，PvuⅡ的等位基因C是中国人群T2DM的保护因素，而XbaⅠ的G等位基因能够降低高加索人群T2DM的发病风险。因此，进行ESR1基因的这两个SNP位点与DN的相关性研究是很有价值的。

本研究显示，等位基因T增加了DN的发病风险，但XbaⅠ的等位基因G是DN发病的危险因素。这说明ESR1基因位点PvuⅡ和XbaⅠ的突变可能会改变ESR1的mRNA和蛋白质的表达水平，从而通过调控雌激素的效应而参与到DN的发病机制中，但具体的发病机制还需进一步探究。本研究说明携带TT、AA基因型基因型的患者更容易发生严重的肾脏损害。所以本研究确定了绝经后女性DN中医证型与ESR1基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性的联系，但是否可以根据ESR1基因多态性确定DN的中医辨证分型，不同的ESR1基因表型对DN中医辨证诊治是否具有参考价值及中医治疗是否会影响到DN患者ESR1基因的表达等还需研究。

研究表明HbA1C在DN患者中按按阴虚燥热、气阴两虚、阴阳两虚呈现递减趋势〔1〕，然而本研究却发现HbA1C在3种证型的患者中差异无显著性，可能是由于本研究纳入的患者无论是哪种证型，对血糖都有所控制。Scr、CysC和UA是评价肾功能的重要指标。ACR是评价肾小球早期损伤的敏感指标，与肾脏病变严重程度关系密切。本研究说明，随着疾病的进展，DN患者的肾功能受损逐渐加重，与张茹等〔1〕的研究结果一致。本研究说明携带T等位基因的阴阳两虚证患者较仅携带C等位基因的患者肾功能损伤程度更为严重。这些结果说明实验室指标与不同的DN中医证型有相关性，且ESR1基因的PvuⅡ和XbaⅠ多态性也与不同证型患者的实验室指标有统计学关联。观察实验室指标及ESR1基因多态性可能对确定DN患者的中医证型有一定的指导意义。DN是一种由多因素导致的病因复杂的疾病，其证型分布受到地域、环境等影响，DN的易感基因较多而且目前尚未完全阐明，因此，在探讨基因多态性与DN中医证型的相关性时仍需进行更加深入的研究。