导致原发性Ⅰ型肾小管酸中毒的SLC4A1突变R388C致病机制的细胞学研究

潘鑫，李亚彩，王晓黎

（中国医科大学附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳 110001）

Ⅰ型肾小管酸中毒又被称为远端肾小管酸中毒 （distal renal tubular acidosis，dRTA），在成人中常继发于其他疾病，如慢性肝脏疾病、自身免疫性疾病、肾移植、药物性肾损伤等。原发性dRTA多见于儿童，致病基因主要为编码位于顶膜H+-ATP酶B1和A4亚单位的ATP6V1B1（MIM：192132） 基 因和ATP6V0A4（MIM：605239） 基因，以及编码基底膜阴离子 （Cl-/HCO3-） 转运体1 （anion exchanger 1，AE1） 的SLC4A1（MIM：109270） 基因［1-2］，其他基因还包括FOXI1（MIM：601093） 基 因［3］和WDR72（MIM：613214） 基因［4］，但较为少见，除此之外还有15%左右的基因位点不明［2，5］。典型dRTA的临床表现为慢性代谢性酸中毒、低钾血症、高尿钙、肾脏钙质沉着和肾结石，尿液偏碱性。但原发性dRTA的临床表现异质性较强，部分不典型dRTA患者有可能至成年后才得到确诊，容易延误诊治［6-7］。本文对我院诊断为dRTA的1例成人患者及其父亲携带的一处新型SLC4A1基因杂合性突变R388C进行了细胞学研究，证实了该突变是导致dRTA的致病原因，并总结了目前已知的可导致dRTA的SLC4A1基因突变的类型和特点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为2018年在我院因低钾血症就诊、经基因诊断为原发性dRTA的1例患者及其父亲，2人均接受了病史采集、甲状腺功能、肾功能、尿常规、甲状腺和肾上腺相关激素以及影像学检查等，明确低钾血症的病因，并进行了二代基因测序。本研究已通过我院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2 检测方法

采用全自动生化仪检测肝肾功能、血离子，采用免疫化学发光法测定促肾上腺皮质激素、皮质醇等。采用放射免疫法测定肾素、血管紧张素、醛固酮、胰岛素等。

提取患者及其父亲基因组DNA，利用经过生物素标记的探针 （P039-Exome，北京迈基诺公司） 与文库DNA杂交，进行外显子捕获，在NextSeq 500 （美国Illumina公司） 上进行高通量测序，测序数据经Burrows-Wheeler Aligner （v.0.7.10-r1039） 软件将其比对到人类基因组并分析 （基因组版本为GRCh37/hg19）。重点筛查与低钾血症临床表型相关的基因，并对检出的基因突变位点在患者及其父亲中采用一代测序验证。

1.3 细胞学实验

使 用GV230 （CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，吉凯基因） 质粒，利用XhoⅠ/KpnⅠ酶切位点导入野生型SLC4A1基因序列 （NM_000342） 和其突变型 （R388C） 基因序列，测序验证后，抽提质粒并保存。培养HEK-293细胞至80%融合度后，利用Lipofectamine 2000试剂盒 （美国 Invitrogen公司） 转染上述质粒至细胞。培养48 h后利用荧光显微镜 （德国徕卡公司） 观察细胞形态。

2 结果

2.1 临床资料

患者，男，30岁，既往有发作性软瘫7年的病史，常因为天气变凉而诱发，实验室检查发现间断低钾血症 （入院后血钾3.33 mmol/L），长期自行补钾治疗。家族史：父亲有类似表现，但未经系统诊治。患者无肾损伤相关用药史和其他肝脏疾病、自身免疫性疾病病史，完善了其他低钾血症病因的相关检查，如肾上腺增强3D-CT未见异常，促肾上腺皮质激素-皮质醇节律和测定值在正常范围，肾素-血管紧张素-醛固酮水平正常，风湿抗体系列正常。因临床表现不典型，且存在家族史，故行二代测序明确低钾原因。

2.2 基因检测结果

全外显子组测序提示，患者携带一处位于SLC4A1基因 （NM_000342） 第11外显子上的杂合性突变 （c.1162C>T，p.Arg388Cys）。Sanger测序验证了本突变，并且对患者亲属的相应位点进行了测序，发现患者父亲携带相同突变 （图1A、1B）。

2.3 细胞学实验

图1 患者的家系图和基因测序结果和SLC4A1基因突变示意图Fig.1 Pedigree of the kindred and sequencing result of SLC4A1 gene with schematic diagram of the mutation sites

将携带野生型和突变型SLC4A1基因序列的GV230质粒转染到HEK-293细胞后，培养48 h后在荧光显微镜下观察发现，转染野生型SLC4A1质粒的细胞可见SLC4A1绿色荧光蛋白分布于细胞表面，提示蛋白合成后可转运至正常位置；而转染突变型SLC4A1质粒的细胞可见SLC4A1绿色荧光蛋白分布在细胞质内，无法达到细胞表面，不能发挥正常作用 （图2）。

图2 转染野生型kAE1和野生型kAE1质粒的HEK293细胞 ×200Fig.2 HEK293 cells transfected with wild-type kAE1 and wildtype kAE1 plasmid ×200

3 讨论

dRTA分为原发性和继发性，继发性因素包括慢性肝脏疾病、自身免疫性疾病、肾移植、药物性肾损伤等，多见于成人。而原发性dRTA多为婴幼儿起病，甚至不能成活，成人起病较为少见，多为不完全性或非经典性，因此较难鉴别，需细致除外继发性因素。典型dRTA的临床表现包括软瘫或抽搐等低钾血症表现、骨骼异常表现 （成人骨软化症、儿童佝偻病、骨折、骨痛等）、感觉神经性耳聋等，实验室检查会发现阴离子间隙正常的代谢性酸中毒、低钾血症、高尿钙、尿液pH值增高，必要时可完善氯化铵试验，判断肾小管的酸化功能。影像学检查会发现肾脏钙质沉着 （常见） 和肾结石 （少见），骨骼呈佝偻病样改变，在部分听力减低的患者中，内耳CT检查可发现前庭导水管扩张［5］。本文的患者以低钾血症就诊，起病年龄较早，并且与其父亲有相似的临床表现，因此考虑遗传性疾病的可能性。由于患者症状不典型，并无其他dRTA临床表现，因此并未首先考虑遗传性dRTA，而是直接进行了二代测序以明确低钾血症的病因，这体现了二代测序在诊断不典型遗传性疾病中的优势。

以往认为遗传性dRTA的致病基因主要为ATP6V1B1基因、ATP6V0A4基因和SLC4A1基因，其中最多见的为ATP6V1B1基因和ATP6V0A4基因 （共占70%），SLC4A1基因突变约占15%左右［2，5］，新近有个例报道FOXI1基因［3］和WDR72基因突变也可以导致遗传性dRTA［4］，此外还有15%的患者家系存在未知的基因突变位点。由于遗传性dRTA的致病基因较多，因此在临床中可疑遗传性dRTA的患者同样应推荐进行性价比较高的二代测序进行基因诊断。

通常ATP6V1B1、ATP6V0A4、FOXI1和WDR72基因突变导致的dRTA的临床表现 （代谢性酸中毒和低钾血症） 要比SLC4A1基因突变导致的dRTA严重 （前3个基因突变的临床表现常伴随耳聋）［3-4，8］。SLC4A1基因编码的蛋白可在肾脏和红细胞膜中表达，在红细胞膜中表达的AE1又称为带3蛋白，是红细胞膜的重要组成成分，因此部分突变类型可造成遗传性球形红细胞血症，从而导致溶血性贫血。在肾脏的α闰细胞中表达的AE1又称为kAE1，可使碳酸氢根与氯离子交换并重吸收入血液。因此，其功能受损会导致酸中毒、低血钾、尿钙增加等一系列dRTA的临床表现。

目前文献已报道导致dRTA的SLC4A1基因突变有36处，遗传模式根据突变类型不同可表现为常染色体显性遗传 （autosomal dominant，AD） 或常染色体隐性遗传 （autosomal recessive，AR）［9-10］，热点区域为第11、13、15和20外显子。AD dRTA的发生机制为kAE1二聚体中的杂合性突变蛋白导致正常kAE1蛋白的运输障碍，又称之为“显性-隐形效应”，如R589H和S613F［11］，以及集中于C端第20外显子的突变，如A888L/D889X （del20bp）［7］、R901X （ins13bp）［12］、D902N［13］、D905dupCGA （ins3bp）［14］、D905G fs15（ins1bp）［15］、E906Q［16］和M909T［17］。而导致AR dRTA最常见的位点是位于第17外显子的G701D［14，18］。本例患者的SLC4A1基因突变R388C位于第11外显子，系kAE1蛋白N端的双性螺旋1 区域 （H1区域），属于高度保守区域，推测R388C可能会引起kAE1构像上的变化，造成其与野生型kAE1形成的杂合二聚体停留在内质网内，无法正常转运至胞膜发挥正常的作用，这也在本研究的细胞实验中得到了证实，在遗传模式和致病机制方面都符合AD 模式的dRTA。SLC4A1基因突变导致的dRTA临床表现异质性较强，甚至相同突变的表现也不尽一致，通常AD模式的临床表现要轻于AR模式［1］。本例患者及其父亲起病时间长，就诊时无酸中毒表现，仅表现为间断低钾血症、碱性尿和高尿钙，父亲甚至常年未正式就医，这与其他AD模式的dRTA临床表现相似［6-7，13］。

dRTA的治疗首要是要及时纠正酸中毒和低钾血症，从而避免出现急性症状和降低慢性并发症的严重程度 （如生长迟缓、肾钙质沉着、骨软化、肾小球滤过率下降等），通常选择碱性药物如枸橼酸钾、枸橼酸钠等；其次是要定期随访，监测血气分析、血离子、尿离子、肾脏超声、骨密度、听力等；三是建议做基因检测，可以选择二代测序，并合理的进行遗传咨询［1］。

综上所述，本文对文献中已报道的SLC4A1基因突变进行了归纳总结，并对前期发现的位于SLC4A1基因H1区域的一处突变R388C进行了发病机制的探讨，细胞学实验证实突变的kAE1蛋白无法达到细胞表面发挥正常的离子转运功能，提示本突变是造成AD dRTA的分子基础。