响应曲面优化离子液体-微波辅助提取黑豆皮中花青素的工艺研究

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

黑豆[Glycine max（L.）merr.]为豆科植物大豆的干燥种子，味甘性平，归肝、肾经，含有黑豆色素、纤维素、果胶、维生素、多糖以及多种微量元素[1]。黑豆皮中的花青素作为一种天然来源的物质，具改善贫血、抗癌、抑制高血糖症、抗氧化和保护视力等功能[2-4]，安全，无毒性，主要通过人工合成和天然植物中提取获得。

目前传统提取方法有提取率较低，耗时长，溶剂使用量大等缺陷。离子液体（ionic liquid）是由无机阴离子和有机阳离子构成的离子型化合物[5]，在黏度、沸点、蒸气压和热稳定性等方面有特殊的理化性质，在中草药提取领域及中药提取领域逐渐应用[6-7]。潘思源等咪唑类离子液体提取桤叶棠棣总黄酮，提取效果优于传统溶剂[8]；黄飞等采用离子液体提取废茶叶中的咖啡因，提取率达到95.1 mg/5 g，高于水提法[9]。微波法提取是利用电磁场的辐射能力，使体系迅速升温从而破坏细胞，在短时间内进行有效分离的一种方法[9]，具有提取效率高、提取效果好、耗时短的特点。我国黑豆资源丰富，但是对黑豆皮的开发利用率较低，通过响应曲面优化离子液体-微波辅助黑豆皮花青素的提取工艺尚未见报道，该研究可为黑豆皮花青素在保健药物及食品中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆：黑龙江绥化市农贸市场；原花青素标准品（98%）：南京世洲生物科技有限公司；1-己基-3-甲基咪唑溴盐、百灵威、无水乙醇、甲醇、香草醛、盐酸：国药试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FW-100型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；MW PRO微波萃取系统：上海安东帕商贸有限公司；Alpha1502型紫外可见分光光度计：上海谱元仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取量的测定

称取原花青素标准品10 mg，制成0.1 mg/mL的标准品溶液。分别量取 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 标准品溶液定容于10 mL容量瓶中，根据香草醛-盐酸法[10]，在500 nm波长处测定吸光度，以原花青素标准液的浓度及吸光度值为横纵坐标，得回归方程为Y＝0.968 5X＋0.004 9，R2＝0.996 2，由回归方程计算原花青素提取量。

1.3.2 花青素提取量的计算

称取一定量的黑豆皮粉末，在不同的料液比、离子液体浓度、温度、时间、功率下微波提取。取适量溶液作为样品溶液，在500 nm波长处测定其吸光度，按照以下公式计算花青素的提取量：

式中：C为花青素质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；M为豆皮质量，g。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取时间

精密称定黑豆皮粉末2.0 g，固定离子液体浓度为0.6 mol/L，料液比 1∶30（g/mL），提取温度 50 ℃，微波功率 500 W，分别考察不同提取时间（5、6、7、8、9 min）对花青素提取量的影响。按1.3项下的方法测定并计算花青素的提取量。

1.3.3.2 料液比

精密称定黑豆皮粉末2.0 g，固定离子液体浓度为0.6 mol/L，提取时间 7 min，提取温度 50℃，微波功率500 W，分别考察不同料液比（1∶10、1∶20、1 ∶30、1∶40、1∶50 g/mL）对花青素提取量的影响。按1.3项下的方法测定并计算花青素的提取量。

1.3.3.3 温度

精密称定黑豆皮粉末2.0 g，固定离子液体浓度为0.6 mol/L，料液比 1 ∶30（g/mL），提取时间 7 min，微波功率500 W，分别考察不同提取温度（30、40、50、60、70℃）对花青素提取量的影响。按1.3项下的方法测定并计算花青素的提取量。

1.3.3.4 离子液体浓度

精密称定黑豆皮粉末2.0 g，固提取时间7 min，料液比1∶30（g/mL），提取温度50℃，微波功率 500 W，分别考察不同离子液体浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）对花青素提取量的影响。按1.3项下的方法测定并计算花青素的提取量。

1.3.3.5 微波功率

精密称定黑豆皮粉末2.0 g，固定离子液体浓度为0.6 mol/L，提取时间 7 min，料液比 1 ∶30（g/mL），提取温度50℃，分别考察不同微波功率（300、400、500、600、700 W）对花青素提取量的影响。按1.3项下的方法测定并计算花青素的提取量。

1.3.4 回归模型的建立

通过单因素的试验结果，以离子液体浓度、微波功率、料液比、提取温度4个因素为中心点，花青素提取量为响应值，进行Box-Behnken试验设计，确定黑豆皮中花青素的最佳提取条件，方案及结果见表1。

表1 响应面因素和水平Table 1 The factor and level of the response surface

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对花青素提取效果的影响

提取时间对黑豆皮花青素提取效果的影响，如图1所示。

图1 提取时间对提取效果的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction efficiency

由图1可知，花青素的提取时间在5 min～9 min时，提取量随时间的延长呈现先快速增大后缓慢降低的趋势。当提取时间超过8 min时，花青素的提取量开始下降。可能是提取时间短花青素未完全溶出，提取量较低；继续延长提取时间，微波辐射还可能会破坏花青素的结构，提取率下降[1]。因此，提取时间选择8 min。

2.1.2 料液比对花青素提取效果的影响

料液比对黑豆皮中花青素提取效果的影响，如图2所示。

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction efficiency

由图 2 可知，当料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50（g/mL）时，花青素的提取量呈现快速增大后缓慢降低的趋势。当料液比超过1∶40（g/mL）时，花青素的提取量开始下降。原因可能是提取体系中溶剂量过小，微波辐射能的传递和吸收无法充分发挥，而且提取溶剂少，体系很快达到饱和，不利于物料的传递。若料液比继续增大，其他非花青素类物质的溶出量也越大，可能干扰花青素的含量测定[12]。因此，提取花青素的料液比选择 1∶40（g/mL）。

2.1.3 提取温度对花青素提取效果的影响

提取温度对黑豆皮中花青素提取效果影响，如图3所示。

图3 提取温度对提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由图3可知，当提取温度在30℃～70℃时，花青素提取量随着温度的升高呈现先快速增大后缓慢降低的趋势。当温度超过60℃时，花青素的提取量开始下降。这是因为黑豆皮中花青素在温度较低的条件下不易充分溶出，温度升高加快了溶剂分子的扩散速度，使其更容易渗透到细胞中，加速花青素的溶出。但是在过高温度的条件下，可能会使花青素结构上的酚羟基被氧化，花青素的结构被破坏，提取量下降[13]。因此，提取花青素的温度选择60℃。

2.1.4 离子液体浓度对花青素提取效果的影响

离子液体浓度对花青素提取效果的影响，如图4所示。

图4 离子液体浓度对提取效果的影响Fig.4 Effect of ionic liquid concentration on extraction efficiency

由图4可知，离子液体浓度在0.2 mol/L～0.8 mol/L时，花青素的提取量随着浓度的增加呈现先快速增大后缓慢降低的趋势。当浓度为0.8 mol/L时，提取量达到最大，随后开始下降。分析其原因可能与离子液体自身的黏度有关，提取体系的浓度过大会降低提取剂对药材的渗透能力，使得黑豆皮花青素的溶出减慢，花青素的提取量下降[14]。因此，提取花青素的离子液体选择0.8 mol/L。

2.1.5 微波功率对花青素提取效果的影响

微波功率对花青素提取效果的影响，如图5所示。

图5 微波功率对效果的影响Fig.5 Effect of microwave power on the extraction efficiency

由图5可知，当微波功率在200 W～600 W之间时，花青素提取量随着微波功率的增大而呈现先增大后减小的趋势。当微波功率达到500 W时，花青素提取量达到最大。可能是分子在微波场的作用下能产生瞬时极化并迅速生成大量的热能，微波能量会导致黑豆粉末细胞破裂，分子运动加快，有利于有效成分的溶解和释放；微波辐射功率过高同时加速了植物细胞内其他杂质的溶出，花青素的溶解量减少[15]，导致提取率下降。因此，提取花青素的微波功率选择500 W。

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面优化结果及方差分析

回归分析结果见表3。

表3 回归分析结果Table 3 The regression analysis results

续表3 回归分析结果Continue table 3 The regression analysis results

采用Design-Expert8.0.6对试验数据进行分析，所建模型的方差分析见表4。得到花青素提取量与各试验因素的多元二次回归方程模型：Y=+4.80+0.035A-0.044B+0.096C-0.14D+0.024AB+0.026AC+0.040AD-0.027BC-0.051BD-0.034CD-0.60A2-0.29B2-0.13C2-0.19D2。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis table

由表3可知，P＜0.0001（极显著）；失拟值P=0.2881＞0.05（不显著），可以说明该回归方程与试验拟合性较好，模型决定系数R2=0.997 3模型拟合程度好，回归方程各项方差分析表明，各因素对黑豆皮花青素含量的影响大小为A＞C＞B＞D。此外，二次项对模型影响均达极显著水平（P＜0.01），交互项 AC、AD、BC、BD、CD 对花青素影响有显著性（P＜0.05），其余项影响不显著（P＞0.05）。通过对回归系数检验可知，各因素花青素提取量的影响顺序为料液比＞离子液体浓度＞提取温度＞微波功率。

2.2.2 响应面试验结果分析

图5为试验各因素对黑豆皮花青素影响的响应面曲图。若考察的两因素交互作用的响应面曲面相对陡峭，说明两两因素间交互作用显著；如果响应曲面相对平滑，说明该两因素交互作用不显著。其中（a）、（b）、（c）、（d）响应曲面相对较陡，表明料液比与提取温度、料液比与离子液体浓度、料液比与微波功率、提取温度与离子液体浓度之间的交互作用比较显著；（e）、（f）响应曲面相对较为平滑，说明提取温度与微波功率、离子液体浓度与微波功率之间交互作用小，对花青素的提取量影响小。该观察结果与模型方差分析结论一致，各因素交互作用对花青素的提取量的影响顺序为 BD＞AD＞CD＞BC＞AC＞AB。

图5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response surface of interaction of various factors

2.2.3 优化条件提取测定结果及验证

利用模型进行预测，最终得出黑豆皮花青素的最佳提取条件：提取时间45min，离子液体浓度0.68mol/L，料液比 1 ∶30.25（g/mL），微波功率 461 W，提取温度49.40℃，理论预计值4.849 mg/g。考虑到实际试验操作的情况，对最佳工艺条件进行调整，最终选择提取时间45 min，离子液体浓度 0.7 mol/L，料液比 1∶30（g/mL），微波功率460 W，提取温度49℃，在此最优条件进行3次平行试验，结果表明花青素提取量为4.834 mg/g，与理论预测值接近，可用于预测不同提取条件下黑豆皮花青素的提取量。

3 结论

通过响应面法优化黑豆皮花青素的提取工艺，确定最佳工艺为：提取时间45 min，离子液体浓度0.7 mol/L，料液比 1 ∶30（g/mL），微波功率 460 W，提取温度49℃，进行3次平行试验；在此条件下黑豆皮花青素的得率可达4.834 mg/g，与模型的预测值相近，表明该模型可靠，本试验得到的花青素提取量与于莉莉等[16]、和曹柏营等[17]相比分别提高了1.25倍和4.39倍，该工艺耗时短、操作简便、提取效率高、溶剂用量少，为今后花青素保健食品及药物的相关的研究提供了一定依据。