康柏西普对豚鼠形觉剥夺性近视的干预作用及相关机制分析△

刘奇奇 高洪莲 刘蓓 李欣蒙 于睿 张磊

近视已成为全球第二大致盲原因。在东亚、东南亚地区，青少年近视患病率高达80%～90%，其中高度近视患病率为10%～20%[1]。高度近视增加了白内障、青光眼、视网膜脱离、黄斑变性等病理性眼病的患病率，这将预示着由病理性近视引起的低视力和失明人口数量的增加。最近有关近视的Meta分析结果显示，到2050年全球将有一半人口患有近视，因此,控制近视发生、发展成为当务之急[2-3]。目前对于近视治疗效果较好且应用最为广泛的药物是硫酸阿托品，它是一种M受体阻滞剂，虽然低剂量阿托品正在试用于临床[4-6]，但是其用于预防、治疗近视相应的机制及可能产生的远期副作用尚不明确，远期临床价值有待进一步研究；还有一些处于试验阶段的药物，如7-甲基黄嘌呤、酮咯酸氨丁三醇等，但是治疗效果及副作用还需进一步研究[7-8]。目前研究已表明，近视主要是眼轴增长引起的，巩膜细胞外基质重塑在眼轴增长过程中起关键作用，而基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2，TIMP-2)之间的失衡可造成细胞外基质重塑[9-10]。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β主要是通过调节成纤维细胞与肌成纤维细胞之间的转化以及调节MMP-2、TIMP-2水平，进而影响细胞外基质合成和分泌的[11-12]。因此，MMP-2、TIMP-2、TGF-β可能是参与近视形成的关键因子。本课题组前期实验发现，适量康柏西普(Conbercept)球结膜下注射对角膜中MMP-2、TGF-β等因子具有调节作用，且对正常角膜无明显副作用[13]。本研究主要通过眼睑缝合法建立豚鼠形觉剥夺性近视模型，探讨0.5 mg Conbercept球结膜下注射对豚鼠形觉剥夺性近视形成的干预作用，并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物普通级3周龄断乳花色豚鼠48只(山东省济南市济南西岭角生物科技有限公司提供)，体质量150～200 g，雌雄不限，裂隙灯下排除眼病，于滨州医学院附属医院动物房饲养，采用日光灯予以照明，明暗周期12 h/12 h，喂养环境温度维持于22～28 ℃，湿度50%，自由摄食、进水。实验动物的使用符合滨州医学院动物管理委员会制定的动物福利伦理规定。

1.1.2 主要试剂与仪器组织RNA快速提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒、PCR反应试剂盒均购自青岛浩赛科技股份有限公司；兔抗鼠MMP-2多克隆抗体(ab97779)、兔抗鼠TIMP-2多克隆抗体(ab180630)、兔抗鼠TGF-β2多克隆抗体(ab102118)、山羊抗兔IgG(H+L)(ab6721)均购自英国Abcam公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体(21898-1-AP)、兔抗鼠GAPDH多克隆抗体(10494-1-AP)均购自Proteintech中国公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒均购自北京碧云天生物科技有限公司；5×蛋白上样缓冲液购自大连美仑公司。荧光定量PCR仪购自美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理采用随机数字表法将48只豚鼠分为空白对照组、单纯手术组、生理盐水组、Conbercept组，每组12只。其中，空白对照组：双眼不进行任何干预；单纯手术组：为保证豚鼠正常觅食，左眼不做干预，仅缝合右眼眼睑；生理盐水组：缝合右眼眼睑，并在缝合时、缝合后7 d给予右眼球结膜下注射0.05 mL生理盐水；Conbercept组：缝合右眼眼睑，并在缝合时、缝合后7 d给予右眼球结膜下注射0.5 mg(0.05 mL)Conbercept(成都康弘生物科技有限公司)。所有术眼术后均给予氧氟沙星眼膏涂眼预防感染。

1.2.2 眼部生物学参数测量分别在眼睑缝合前、缝合后7 d、缝合后14 d测量各组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度。测量后使用手持裂隙灯观察角膜、结膜等组织，直接检眼镜观察眼后段。其中，屈光度测量前均使用复方托吡卡胺滴眼液滴右眼，每15 min滴1次，共3次，由同一位检影验光经验丰富的专业临床检影师使用带状光检影验光，连续检影5次，取其平均值。眼轴长度测量前均使用盐酸丙美卡因滴眼液滴右眼，行角膜表面麻醉，由同一位经验丰富的专业临床技师使用眼部A超测量仪测量眼轴长度，连续测量5次，取其平均值。

1.2.3 标本收集每组分别随机抽取眼睑缝合后7 d、14 d豚鼠各6只，使用颈椎脱臼法处死豚鼠后，摘取右眼眼球，于冰块上快速取后极部巩膜，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 RT-PCR检测巩膜中MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1 mRNA的表达按照组织RNA快速提取试剂盒说明书提取巩膜中RNA，紫外分光光度计测定所提取RNA浓度，然后反转录合成cDNA。以GAPDH为内参，根据NCBI所提供基因序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物序列。按照2×SYBR Green qPCR Mix说明书设置PCR反应条件，使用2-△△Ct法进行分析。RT-PCR引物序列：GAPDH上游引物：5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’，下游引物：5’-CAGCGTCAAAAGTGGAAGAATG-3’；MMP-2上游引物：5’-TGCCTGACCCTCTGTTGCT-3’，下游引物：5’-CAGGAGCTGGTTGCTGAGGT-3’；TIMP-2上游引物：5’-GATGTCGGTGGGAAGAAGGA-3’，下游引物：5’-CAATGAAGTCACAGAGGGTGATG-3’；TGF-β2上游引物：5’-GTGGTGATCAGAAAACT-3’，下游引物：5’-CATGCTCCAGCACAGAAGTT-3’；TGF-β1上游引物：5’-TGATAACCTGGATGCCGTTG-3’，下游引物：5’-TGCTTCCAAACTTCACGCTCT-3’。

1.2.5 Western blot检测各蛋白表达收集各组豚鼠巩膜后于冰上研磨并加裂解液裂解15 min，转移至EP管，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，BCA法测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸15 min，经电泳、转膜后，50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(MMP-2、TIMP-2、TGF-β1稀释度均为 11000；TGF-β2稀释度为1500；GAPDH稀释度为15000)，4 ℃孵育过夜，TBST冲洗3次×10 min，加入二抗室温孵育2 h，TBST冲洗3次×10 min，化学发光法显影，Image Lab软件分析灰度值。

2 结果

2.1 眼部生物学参数48只豚鼠右眼眼睑缝合前均呈远视状态，4组间豚鼠右眼眼轴长度、屈光度差异均无统计学意义(均为P>0.05)。眼睑缝合后各组豚鼠角膜、结膜、视网膜等组织均未见明显异常。眼睑缝合后7 d、14 d，单纯手术组、生理盐水组、Conbercept组豚鼠眼轴长度、屈光度与空白对照组相比，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，且单纯手术组与生理盐水组比较，右眼眼轴长度(P7 d=0.704；P14 d=0.382)、屈光度(P7 d=0.596；P14 d=0.927)差异均无统计学意义。眼睑缝合后7 d，Conbercept组与生理盐水组比较，右眼眼轴长度、屈光度差异均无统计学意义(P=0.105、0.723)；眼睑缝合后14 d，两组豚鼠右眼眼轴长度、屈光度差异均具有统计学意义(均为P<0.001)。见表1。

表1 各组豚鼠不同时间点右眼眼轴长度、屈光度比较

2.2 RT-PCR检测结果眼睑缝合后7 d、14 d，单纯手术组与生理盐水组比较，MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1的mRNA表达差异均无统计学意义(均为P>0.05);单纯手术组与空白对照组比较，MMP-2、TGF-β2 mRNA相对表达量均增多，TIMP-2、TGF-β1 mRNA相对表达量均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.01);Conbercept组与生理盐水组比较，MMP-2、TGF-β2 mRNA相对表达量均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，两组间TIMP-2 mRNA相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。眼睑缝合后7 d，Conbercept组与生理盐水组比较，TGF-β1 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P=0.124)，眼睑缝合后14 d，两组间TGF-β1 mRNA相对表达量差异具有统计学意义(P=0.007)。见表2。

表2 各组豚鼠不同时间点各因子mRNA相对表达量

表2 各组豚鼠不同时间点各因子mRNA相对表达量

组别MMP-2 mRNA缝合后7 d缝合后14 dTIMP-2 mRNA缝合后7 d缝合后14 dTGF-β2 mRNA缝合后7 d缝合后14 dTGF-β1 mRNA缝合后7 d缝合后14 d空白对照组2.64±0.343.76±0.494.94±0.273.30±0.222.46±2.883.40±0.256.48±1.646.44±1.14单纯手术组71.17±23.66∗108.43±9.26∗3.00±0.10∗1.07±0.15∗34.67±2.51∗63.33±5.51∗3.60±0.10∗2.90±0.32∗生理盐水组66.33±11.67111.33±3.713.03±0.251.03±0.2536.33±4.5161.33±5.513.77±0.153.10±0.52Conbercept组38.76±3.25△25.57±0.75△3.23±0.151.40±0.619.17±4.62△9.57±0.58△2.33±0.210.87±0.05△F值28.190559.92776.30344.537202.320301.74011.48733.522P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0010.000

注：与空白对照组相比，*P<0.01；与生理盐水组相比，△P<0.05

2.3 Western blot检测结果Western blot检测结果显示，眼睑缝合后7 d、14 d，单纯手术组与空白对照组比较，MMP-2、TGF-β2蛋白表达量均增多，差异均有统计学意义(均为P<0.01)，TIMP-2、TGF-β1蛋白表达量均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；Conbercept组与生理盐水组比较，MMP-2、TGF-β2、TGF-β1蛋白表达量均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.01)，TIMP-2蛋白表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)；单纯手术组与生理盐水组比较，MMP-2、TGF-β2、TIMP-2、TGF-β1蛋白表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图1。

图1 各组不同时间点各因子蛋白表达情况 A：缝合后7 d时Western blot电泳图；B：缝合后7 d时各因子蛋白相对表达量；C：缝合后14 d时Western blot电泳图；D：缝合后14 d时各因子蛋白相对表达量。1：空白对照组；2：单纯手术组；3：生理盐水组；4：Conbercept组

3 讨论

目前眼科学者们大多认可近视主要是由眼轴增长引起的，巩膜细胞外基质重塑是眼轴增长的主要机制。MMP-2因可降解巩膜中主要成分Ⅰ型胶原而受到关注，它可使巩膜胶原降解增加，进而使巩膜变薄；TIMP-2是MMP-2的抑制因子，可降低巩膜中胶原的降解；正常情况下两者处于动态平衡状态，当两者平衡打破，巩膜细胞外基质代谢发生异常，导致巩膜细胞外基质重塑[14-15]。有研究表明，缺氧引起巩膜成纤维细胞转化和胶原形成，可造成巩膜细胞外基质重塑，进而影响近视形成，且抗缺氧药物可抑制近视形成[16]。肌成纤维细胞特异性表达的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，是细胞外基质合成的主要细胞，TGF-β是一种调节成纤维细胞与肌成纤维细胞转化的重要因子。以往研究证明，TGF-β2可上调MMP-2表达，高水平TGF-β1可诱导TIMP-2表达[11-12]。因此，MMP-2、TIMP-2、TGF-β作为调控细胞外基质重塑的重要因子，可能参与近视的形成过程。国内外已有大量实验研究证明，近视形成过程中伴随着MMP-2、TIMP-2、TGF-β等因子活性的改变，以及外源性应用调节MMP-2、TIMP-2、TGF-β活性的药物可影响近视形成过程[17-18]。

Conbercept是由中国研发的一种抗新生血管生长因子融合蛋白，是一种由VEGFR1的2号决定簇和VEGFR2的3号、4号决定簇与人免疫球蛋白G的Fc段结合形成的人源化重组融合蛋白，可与VEGF-A、VEGF-B和胎盘生长因子(PIGF)的所有亚型结合，由于在Fab段添加了VEGFR-2的4号决定簇，因此较其他抗新生血管生成的药物，如雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普等对VEGF表现出更高的结合力[19]。目前，Conbercept主要应用于减少VEGF生成以预防、治疗眼部新生血管形成及黄斑部水肿等疾病[20-21]。既往研究发现，贝伐单抗能够直接或间接影响TGF-β、MMP-2、α-SMA表达及低剂量抗VEGF药物联合伊马替尼治疗可促进形成正常血管，改善缺氧状态，玻璃体内注射阿柏西普、雷珠单抗可影响眼内TGF-β、MMP表达水平[22-23]，同时本课题组在Conbercept对兔角膜PRK术后Haze形成影响的研究中证实，Conbercept同样可影响角膜中的TGF-β、MMP-2、α-SMA表达[13]。因此，本实验主要为研究Conbercept是否对巩膜中MMP-2、TGF-β、TIMP-2有调节作用，进而影响形觉剥夺性近视形成过程，结果表明，Conbercept也可调节巩膜中MMP-2、TGF-β1、TGF-β2表达水平，进而影响形觉剥夺性近视形成过程。

本实验结果显示，球结膜下注射0.05 mL生理盐水、0.5 mg Conbercept对角膜、结膜、视网膜等组织均无明显副作用；单纯缝合眼睑后7 d，便可诱导形成相对近视，此时巩膜中MMP-2、TGF-β2相对表达量均显著提高，TIMP-2、TGF-β1相对表达量均显著降低，这与Zhao等[9]、张兰兰等[24]的研究结果一致；球结膜下注射生理盐水对形觉剥夺性近视形成过程无明显影响；0.5 mg Conbercept球结膜下注射后7 d，与生理盐水组比较，眼轴长度、屈光度差异虽无统计学意义，但MMP-2、TGF-β2相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，表明球结膜下注射0.5 mg Conbercept 7 d后(即眼睑缝合后7 d)已对巩膜中近视形成相关因子MMP-2、TGF-β2产生抑制作用；眼睑缝合后14 d时，Conbercept组与生理盐水组比较，眼轴长度、屈光度均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，表明0.5 mg Conbercept对形觉剥夺性近视形成产生抑制作用，同时伴有MMP-2、TGF-β2相对表达量降低。本实验中眼睑缝合后14 d时，Conbercept组中TGF-β1相对表达量低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)，与以往刘蓓等[13]实验证实的Conbercept对TGF-β1产生抑制作用相一致。缝合后7 d 、14 d，Conbercept组与生理盐水组比较，TIMP-2相对表达量差异均无统计学意义，可能是由于Conbercept对TIMP-2表达无调节作用或Conbercept对TIMP-2的作用浓度或作用时间不足。本实验结果表明，0.5 mg Conbercept球结膜下注射后7 d便可对形觉剥夺性近视形成过程中巩膜中的MMP-2、TGF-β2表达产生抑制作用，注射后14 d时对形觉剥夺性近视形成中眼轴长度、屈光度产生抑制作用。但是本实验只是从生物学测量角度表明0.5 mg Conbercept对形觉剥夺性性近视形成有抑制作用，从mRNA、蛋白水平验证Conbercept对MMP-2、TGF-β2、TGF-β1表达有抑制作用，其作用的信号通路尚不明确。因此，我们需进一步研究Conbercept作用的具体信号通路，为以后抑制近视形成提供新的思路以及预测Conbercept用于治疗近视可能带来的副作用，同时此次实验只是研究证明0.5 mg Conbercept对形觉剥夺性近视产生抑制作用，还需在此实验基础上进一步研究Conbercept对形觉剥夺性近视形成产生抑制作用的最佳浓度、剂量及时间，为以后Conbercept用于临床控制近视形成提供实验基础。