三阴乳腺癌组织Ki-67、miR-155、MUC1表达变化及其临床意义

王延涛，陈伟娜

青岛市第八人民医院，山东青岛266100

三阴乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种特殊亚型，占所有乳腺癌的15%～20%。与其他类型乳腺癌相比，TNBC具有侵袭性强、远处转移风险高和预后差等特点[1]。细胞核增殖相关抗原Ki-67是在增殖细胞中表达的一种核抗原，与细胞有丝分裂有关。研究发现，Ki-67表达变化与多种肿瘤的浸润、转移密切相关[2]。王仙玲[3]研究发现，在TNBC组织中Ki-67高表达，而Ki-67低表达是TNBC患者无病生存期延长的保护性因素。微小RNA-155(miR-155)是miRNA家族成员之一。有研究发现，miR-155在乳腺癌诊断和预后评估中具有潜在的应用价值[4]。段卫明等[5]认为，miR-155可作为预测TNBC患者术后复发的生物标志物。黏蛋白1(MUC1)是分布于机体正常黏膜表面的高分子量糖蛋白，其分子由肽核心和糖链组成，对正常上皮组织具有润滑和保护作用。近年研究发现，MUC1是一种重要的肿瘤相关抗原，与肿瘤细胞的增殖、浸润和迁移有关[6，7]。但目前Ki-67、miR-155、MUC1表达与TNBC发生、发展关系的报道相对较少。为此，本研究观察了TNBC组织Ki-67、miR-155、MUC1表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年1～12月青岛市第八人民医院收治的TNBC患者85例。所有患者经术后病理组织学检查明确乳腺癌诊断[8]，免疫组化染色提示雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性，符合TNBC。纳入标准：①符合TNBC诊断；②初诊，术前未接受任何抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②男性；③有家族遗传性疾病者。患者年龄38～64(51.23±6.47)岁，其中<50岁42例、≥50岁43例；绝经38例，未绝经47例；组织分化程度：低分化16例，中分化18例，高分化51例；肿瘤直径：≤2 cm 27例，>2 cm 58例；临床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例；有淋巴结转移36例，无淋巴结转移49例。本研究经青岛市第八人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 Ki-67、MUC1表达检测 采用免疫组化法。取手术切除的TNBC组织及其配对的癌旁正常组织，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。切片经70 ℃烘箱烤片2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液中高温高压修复抗原，自然冷却至室温。正常山羊血清工作液封闭，然后滴加鼠抗人Ki-67、MUC1单克隆抗体，37 ℃孵育2 h，滴加生物素标记的羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。以羊抗人IgG代替一抗作为阴性对照，已知Ki-67、MUC1阳性标本作为阳性对照。

采用双盲法由两位病理科医师独立阅片。Ki-67阳性染色定位于细胞核，呈棕黄色颗粒；MUC1阳性染色定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。每张切片随机选取5个200倍视野，评估每视野染色强度；每视野计数1 000个细胞，计算阳性细胞比例。染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例评分：<5%为0分，5%～<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～<75%为3分，≥75%为4分。以染色强度评分和阳性细胞比例评分综合评定阳性表达，二者乘积>4为阳性表达。

1.3 miR-155表达检测 采用RT-PCR法。取手术切除的TNBC组织及其配对的癌旁正常组织，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA纯度和浓度合格，可用于后续实验。按PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明将总RNA反转录为cDNA。反转录条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。以cDNA为模板，按2×SYBR Green qPCR Mix说明进行PCR扩增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：miR-155上游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG-3′，下游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT-3′；内参U6上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-3′，下游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。PCR反应体系共20 μL：2×SYBRGreen qPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free H2O 8.2 μL；反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 TNBC组织与癌旁正常组织Ki-67、miR-155、MUC1表达比较 TNBC组织与癌旁正常组织Ki-67阳性表达率分别为80.00%(68/85)、56.47%(48/85)，miR-155相对表达量分别为1.32±0.17、0.76±0.23，MUC1阳性表达率分别为77.65%(66/85)、62.35%(53/85)。TNBC组织Ki-67、MUC1阳性表达率均高于癌旁正常组织(χ2分别为10.856、4.734，P均<0.05)，miR-155相对表达量亦高于癌旁正常组织(t=18.052，P<0.05)。

2.2 TNBC组织Ki-67、miR-155、MUC1表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 TNBC组织Ki-67、miR-155、MUC1表达与患者临床病理特征的关系

2.3 TNBC组织Ki-67、miR-155、MUC1表达的关系 Spearman等级相关分析显示，TNBC组织Ki-67表达与miR-155、MUC1表达均呈正相关关系(r分别为0.713、0.647，P均<0.05)，miR-155表达与MUC1表达亦呈正相关关系(r=0.596，P<0.05)。

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，约占女性恶性肿瘤的30%，已成为威胁女性健康的主要病因。TNBC是乳腺癌的一种特殊亚型，占所有乳腺癌的15%～20%。与其他类型乳腺癌相比，TNBC具有侵袭性强、远处转移风险高和预后差等特点。由于TNBC的激素受体和HER-2受体均阴性，无内分泌治疗和抗HER-2受体靶向治疗指征，联合化疗成为其内科治疗的主要手段，但常规化疗往往效果不佳，而化疗效果不佳的TNBC患者2年内复发的风险较高，预后和生存状况较差。因此，寻找TNBC新的治疗靶点成为近年研究的热点。

Ki-67是一种非组蛋白性核蛋白，存在于具有增殖活性的细胞核中，与细胞有丝分裂密切相关，是反映细胞群体增殖活性的良好指标。研究发现，Ki-67表达变化与多种肿瘤的浸润、转移密切相关[2]；Ki-67表达越高，肿瘤恶性程度越高，越容易发生侵袭和转移[9，10]。邢芳林等[11]研究发现，TNBC患者Ki-67阳性指数明显高于非TNBC患者，推测Ki-67可作为预测肿瘤生物学行为和判断患者预后的生物学指标。本研究结果发现，TNBC组织Ki-67阳性表达率明显高于癌旁正常组织；TNBC组织Ki-67阳性表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移有关，而与患者年龄、绝经状态、肿瘤直径和组织分化程度无关。提示TNBC组织Ki-67高表达，其表达变化与TNBC的发生、发展密切相关。

miRNA是一类短序列、非编码单链小分子RNA，其转录后能够参与基因表达的调控，从而影响生物体内细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。miR-155作为miRNA家族成员之一，基因定位于染色体21q21，在甲状腺癌、胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤组织中异常表达，被认为是一种癌性miRNA[12]。有研究发现，miR-155能够改变人乳腺癌MCF-7细胞转录组，激活丝裂原活化蛋白激酶信号，参与乳腺癌的恶性转化[13]。Kia等[14]研究发现，miR-155可通过抑制性别决定区Y框蛋白表达促进TNBC细胞的增殖、侵袭和迁移。本研究结果发现，TNBC组织miR-155相对表达量明显高于癌旁正常组织；TNBC组织miR-155表达与肿瘤组织分化程度、淋巴结转移有关，与患者年龄、绝经状态、肿瘤直径和临床分期无关，与谢小红等[15]研究结果一致。提示TNBC组织miR-155表达升高，其表达变化与TNBC的发生、发展有关。

MUC1为异源二聚体跨膜糖蛋白，编码基因定位于染色体1q21，含有7个外显子。正常情况下，MUC1主要表达于组织、器官上皮细胞近管腔或腺腔面，如胃肠道、泌尿生殖道、乳腺等，呈极性分布，具有润滑和保护上皮组织作用。近年研究发现，MUC1还能介导细胞与细胞、细胞与基质间的相互黏附，从而参与肿瘤的侵袭和转移，在多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中异常表达[16]。Sun等[17]研究报道，90%以上的乳腺癌组织MUC1过表达。本研究发现，TNBC组织MUC1阳性表达率明显高于癌旁正常组织，进一步证实TNBC组织MUC1高表达。孟迪等[18]研究表明，MUC1在TNBC组织中不存在表达优势，且与患者预后相关的临床病理特征无关，如临床分期、组织分化程度、淋巴结转移等。本研究结果发现，TNBC组织MUC1表达与肿瘤淋巴结转移有关，与患者年龄、绝经状态、组织分化程度、肿瘤直径、临床分期无关，与孟迪等[18]报道并不一致。有研究认为，当细胞癌变时MUC1的极性分布被破坏，细胞表面分子间的黏附作用降低，导致肿瘤细胞迁移[19]。因此，TNBC组织MUC1表达变化与TNBC的发生、发展有关。

本研究结果还发现，TNBC组织Ki-67表达与miR-155、MUC1表达均呈正相关关系，miR-155表达与MUC1表达亦呈正相关关系，提示Ki-67、miR-155、MUC1共同参与了TNBC的发生、发展。但目前三者在TNBC中相互作用的机制尚不清楚，还有待于进一步研究。

综上所述，TNBC组织Ki-67、miR-155、MUC1表达明显升高，三者可能共同参与TNBC的发生、发展。由于本研究未观察TNBC组织与其他类型乳腺癌组织Ki-67、miR-155、MUC1表达变化，Ki-67、miR-155、MUC1能否作为TNBC诊断、治疗和预后评估的生物标志物尚不清楚，还需今后进一步研究。