微小RNA-149- 5 p在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达情况及作用机制

王战芳，张芳芳，韩阳利，王敏芳

平顶山市第一人民医院血液科，河南 平顶山4670000

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一种常见的淋巴系统肿瘤，属于非霍奇金淋巴瘤[1]。DLBCL的名字来源于其生长方式，呈弥漫生长模式[2]。DLBCL包括活化B细胞样和生发中心B细胞样两种[3]。miRNA-149-5p是一种微小RNA（microRNA，miRNA），长度为18～25个核苷酸，占人类总基因的1%左右[4]。miRNA可以通过影响人体内信号通路调节恶性肿瘤的发生和发展[5]。有研究表明，miRNA-149-5p与肿瘤、心血管疾病、免疫系统疾病均有密切关系[6]。但目前关于miRNA-149-5p调控DLBCL发生和发展的机制尚不明确。本研究分析DLBCL中miRNA-149-5p、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/p65信号通路和相关凋亡因子B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、胱天蛋白酶 3（caspase 3）及Ki-67蛋白的表达情况，探讨其与DLBCL的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年1月1日至2017年1月1日于平顶山市第一人民医院就诊的DLBCL患者。纳入标准：符合《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南》[7]中DLBCL的诊断标准；经组织病理学检查确诊为DLBCL。排除标准：合并其他肿瘤；合并严重的心肺疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入150例DLBCL患者，作为观察组。另选取同期70例淋巴结反应性增生患者，作为对照组。DLBCL组中，男78例，女72例；年龄12～75岁，平均（45.21±3.02）岁；75例患者检查了血清乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH），LDH水平正常（≤245 U/L）40例，LDH水平升高（＞245 U/L）35例；109例患者检查了血清β2微球蛋白（β2 microglobulin，β2-MG），β2-MG水平正常（1～3 mg/L）41例，β2-MG水平升高（＞3 mg/L）68例；淋巴瘤国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分：0～2分71例，3～5分79例。对照组中，男35例，女35例；年龄14～74岁，平均（46.39±4.97）岁。两组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、无水乙醇、异丙醇均购自天津科密欧化学试剂有限公司；逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、miRNA-149-5p上下游引物均购自美国Gene Copoeia公司；Bcl-2抗体、caspase 3抗体、Ki-67抗体、NF-κB/p65抗体均购自美国Abcam公司；低温离心机购自无锡市龙泰化工机械设备有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应仪、电泳仪均购自美国Bio-Rad公司；石蜡切片机购自德国LEICA公司。

1.3 RT-PCR检测miRNA-149- 5 p的相对表达量

采用胰蛋白酶预处理样本，应用Trizol提取细胞总RNA，采用分光光度计测定RNA的纯度和浓度，反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行RTPCR，反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 8 s，58 ℃ 35 s，72℃40 s，共40个循环，以GADPH基因为内参，采用 2-ΔΔCt法计算 miRNA-149-5p 的相对表达量。miRNA-149-5p上游引物：5'-GTGAGGTTCTTGGGAGCCAA-3'，下 游 引 物 5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3'。GADPH上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下 游 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。依据miRNA-149-5p相对表达量的不同，将DLBCL患者分为miRNA-149-5p高表达组（miRNA-149-5p相对表达量＞1.5）和miRNA-149-5p低表达组（miRNA-149-5p相对表达量≤1.5）。

1.4 免疫组织化学染色方法及结果判定

采用3%的H2O2浸泡组织切片10 min，采用0.01 mol/L枸橼酸缓冲液高压修复2 min。加入一抗4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育30 min。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染10 s，梯度乙醇脱水后常规透明，封片，在400倍光学显微镜下随机选取10个视野观察。依据NF-κB/p65、caspase 3、Bcl-2阳性细胞比例和染色强度进行评分。阳性细胞比例评分：0%～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；依据染色强度评分：无色为0分，轻度染色为1分，中度染色为2分，深度染色为3分。阳性细胞比例评分与染色强度评分相乘，≤2分为阴性，＞3分为阳性[8]。Ki-67阳性细胞百分比≤40%为阴性，＞40%为阳性[9]。

1.5 随访

采用电话、门诊方式对患者进行随访，随访截止时间为2020年1月30日。比较miRNA-149-5p高表达组和低表达组患者的3年生存情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-149- 5 p相对表达量的比较

观察组患者的miRNA-149-5p相对表达量为（1.32±0.14），明显低于对照组的（4.36±1.02），差异有统计学意义（t=24.797，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征DLBCL患者中miRNA-149- 5 p表达情况的比较

miRNA-149-5p表达情况可能与DLBCL患者的年龄、性别、临床分期、LDH水平、β2-MG水平无关（P＞0.05），可能与Hans分型有关（P＜0.01）。（表1）

2.3 NF- κB/p65、Bcl- 2、caspase 3、Ki-67蛋白表达情况的比较

观察组中NF-κB/p65、Bcl-2、Ki-67蛋白阳性率均明显高于对照组，caspase 3蛋白阳性率明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表1 不同临床特征DLBCL患者中miRNA-149- 5 p表达情况的比较（n=150）

表2 两组患者中NF- κB/p65、Bcl- 2、caspase 3、Ki-67蛋白阳性情况的比较[n（%）]

2.4 生存情况的比较

miRNA-149-5p高表达组患者的3年生存率为46.4%（51/110），明显高于miRNA-149-5p低表达组的17.5%（7/40），差异有统计学意义（χ2=10.304，P＜0.01）。

3 讨论

NF-κB是一种核转录因子，其活化后与多种肿瘤的发生发展有着密切的联系[10]。本研究结果显示，DLBCL患者中miRNA-149-5p的表达水平明显降低，NF-κB的表达水平升高，说明miRNA-149-5p低表达和NF-κB高表达可能促进DLBCL的发生和发展。

miRNA-149-5p过表达会促进细胞内凋亡相关蛋白的表达，胱天蛋白酶（caspase）家族就是其中之一，caspase 3、caspase 9是caspase家族中重要的凋亡蛋白[11]。caspase 9基因处于caspase家族激活基因的最前端，可以剪切caspase底物引起级联反应，导致细胞凋亡[12]。miRNA-149-5p过表达还可促进Bcl-2家族蛋白的表达，Bcl-2家族中主要有Bcl-2蛋白和Bax蛋白，这两种蛋白分别具有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的功能[13-15]。郝紫腾等[16]研究表明，caspase家族是细胞凋亡的主要因素之一。miRNA-149-5p可以激活caspase家族的凋亡启动子caspase 9，使凋亡因子启动并促进级联反应的发生，导致肿瘤细胞凋亡。本研究结果显示，DLBCL患者中caspase 3表达水平降低，可能是由于miRNA-149-5p呈低表达，无法激活凋亡启动子caspase 9。本研究结果表明，DLBCL患者中Bcl-2表达水平升高，抑制了DLBCL细胞的凋亡，与周倩萍[17]的研究结果一致。谭亚和周贤[18]的研究表明，miRNA可作用于抑癌基因和促癌基因，且与DLBCL的关系密切。除了促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖也是重要的方法之一，肿瘤细胞的增殖受到相关基因（如Ki-67）表达水平的影响。Ki-67是增殖细胞核抗原，其分子量为345 kD，与细胞增殖密切相关。当Ki-67高表达时，细胞的有丝分裂加速，细胞增殖加速；当Ki-67低表达时，细胞的增殖速率降低[19]。本研究结果显示，观察组中Ki-67蛋白阳性率明显高于对照组，说明DLBCL患者中miRNA-149-5p低表达可能促进了Ki-67蛋白的表达，促进了肿瘤细胞增殖，导致肿瘤的恶性发展。此外，本研究还表明，miRNA-149-5p表达情况可能与DLBCL患者的年龄、性别、临床分期、LDH水平、β2-MG水平无关（P＞0.05），可能与Hans分型有关（P＜0.01）。

综上所述，DLBCL患者中miRNA-149-5p表达下调，可能通过凋亡途径影响肿瘤的发生，miRNA-149-5p低表达可能与DLBCL患者预后不良有关。但调控DLBCL的信号通路较多，在后续的实验中可探讨其他信号通路对DLBCL影响的机制。