亚麻木酚素通过调控TXNIP/NLRP3信号通路改善CIH小鼠心肌损伤

任 静，郭亚净，刘 寒，周 健，吉恩生

(河北中医学院基础医学院生理教研室，低氧生理与病理生理实验室,河北 石家庄 050020)

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea，OSA)主要表现为夜间睡眠过程中反复出现的上气道不完全或完全阻塞[1]。其特有的病理过程慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)，是引发心血管疾病的独立危险因素[2]。近年来国内外研究证实，氧化应激是在众多心血管疾病中的主要因素，如心肌肥大、心力衰竭、动脉粥样硬化和缺血性心脏病[3]。有研究表明，与间歇性低氧缺氧/再氧合过程类似的心肌缺血/再灌注损伤诱发心肌细胞氧化应激，大量产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)促使硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin interaction protien，TXNIP)与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3( the pyrin domain containing 3，NLRP3) 相互结合，并激活NLRP3受体，促进NLRP3炎性复合体形成，激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)，进而使白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)等炎性因子表达水平升高，进而造成小鼠心肌损伤[4-6]。

亚麻木酚素 (secoisolariciresinol diglucoside，SDG)为亚麻籽的主要生物成分，其含量约为其他植物的75～800倍[7]。SDG具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗血小板聚集、抗癌以及清除自由基的作用[1]。有研究证明，在离体缺血/再灌注模型中，SDG具有促进血管生成和抗凋亡的特性，起到心脏保护作用[8]。且研究显示，SDG可以直接清除自由基，抑制ROS的生成[9]。因此，本研究探讨SDG是否通过调控ROS-TXNIP-NLRP3信号通路，从而改善CIH诱发的小鼠心肌损伤，旨在为临床防治OSA提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物健康成年♂ C57BL/6小鼠18只，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号:SCXK[京]2016-0006。动物饲料购自江苏协同医药生物工程股份有限公司。动物在特定的无致病性条件下饲养，12 h光照/12 h暗周期，自由饮水，室内温度控制在(25±1) ℃。

1.2 主要试剂与设备

1.2.1主要药品与试剂 SDG(爱必信生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ELISA检测试剂盒TNF-α、IL-6、IL-1β(武汉华美生物工程有限公司)；抗TXNIP、抗NLRP3、抗caspase-1、抗IL-1β和抗IL-18抗体(ABclonal公司)；抗含CARD的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)抗体(Abcam公司)；兔抗鼠Tublin单克隆抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)；Tween-20、PIPA裂解液和苯甲基磺氟(phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2.2仪器设备 CIH氧舱(Oxyeycler Model 84，BioSpherix公司，美国)；正置显微镜(DMEB，Leica公司，德国)；全自动酶标分析仪(EPOCH，Thermo Fisher公司，美国)；多功能成像系统(Vilber Fusion FX5 Spectra，Vilber Lourmat，法国)

1.3 主要方法

1.3.1造模与分组 将C57BL/6小鼠(n=6)随机平均分为3组：常氧组、CIH组和CIH+SDG组。小鼠自由饮食，适应性饲养1周，在日间进行造模。将CIH组和CIH+SDG组小鼠置于CIH舱中，前1.5 min向舱内充入100%氮气，使氧气浓度降至9%，后1.5 min充入纯氧，使氧气浓度升至21%，每一循环3 min。与此同时，将常氧组置于相同规格的舱内，但向舱内冲入空气。每天8 h(9 AM～5 PM)上舱，每周7 d，持续5周，共35 d。每天造模前，CIH+SDG组给予SDG溶液灌胃(用药量30 mg·kg-1)，以药理研究方法学的小鼠与临床人用药量折算方法折算，CIH与常氧组灌服同等体积的生理盐水。

1.3.2动物标本采集 ① 一般信息采集：每天观察小鼠行为和生理变化，造模35 d后，取材前，称量小鼠体质量(body weight,BW)。② 血液采集：造模35 d后，1%戊巴比妥钠，按体重100 μL·g-1，腹腔注射。并进行目内眦取血，存放于促凝管中，室温放置30 min后，4 ℃、1 500 r·min-1、离心15 min后取上清液置于-80 ℃保存。③ 造模结束(35 d)后，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，小鼠仰卧位固定于手术操作板上，暴露胸腔。迅速摘取心脏并移去多余组织，并称心脏质量(heart weight，HW)，计算小鼠心脏质量(HW)/体质量(BW)的比值。心脏组织，用生理盐水冲洗，放于无菌无酶冻存管内，置于-80 ℃保存，待Western blot检测。心尖放于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片。

1.3.3小鼠心肌损伤情况检测 HE染色，光镜下观察各组小鼠心肌组织病理学变化，每张切片随机选取4个视野进行拍照。检测各组小鼠血清生化指标LDH、CK的水平，按照试剂盒说明书检测。

1.3.4TBA、NBT法检测心肌组织中氧化应激指标 取小鼠心肌组织匀浆，离心后取上清检测MDA、SOD含量，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.5酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量 用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，促凝血3 000～4 000 r·min-1，离心10 min，取上清，4℃冰箱存放，待测。

1.3.6Western blot检测小鼠心肌组织中TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β的蛋白表达情况 小鼠心肌组织20 mg左右，每100 mg组织加入裂解缓冲液(磷酸蛋白酶抑制剂A ∶B ∶cocktail ∶PMSF=1 ∶1 ∶2 ∶1)1 mL置于冰上，随之进行机械破碎和超声破碎，使组织充分裂解。12 000 r·min-1、4 ℃、离心15 min，取上清。采用BCA法进行蛋白样定量，测好蛋白浓度后根据蛋白样体积：4×buffer=3 ∶1的比例加入4×buffer，剩余用水补充，上样量至10 μL。封口，于沸水中煮沸5 min，使蛋白充分变性，-20 ℃保存备用。

2 结果

2.1 亚麻木酚素对CIH小鼠心肌损伤的改善作用

2.1.1亚麻木酚素对CIH小鼠心肌组织病理学表现的影响 HE染色结果，常氧组小鼠心肌细胞排列整齐，胞核居中，呈完整的圆形或椭圆形，胞间内无水肿，未见心肌纤维化等明显的病理损伤；CIH组小鼠心肌细胞排列紊乱，胞核坏死，细胞明显肿胀，胞间隙增大，严重颗粒变性、空泡变性，同时还有炎症细胞浸润，心肌纤维断裂溶解、坏死，纤维化等病理改变；CIH+SDG组与CIH组相比，心肌组织纤维化程度明显减轻，细胞形态大致完整，见Fig 1。从病理切片来看，CIH对心肌细胞造成了实质性损伤，此外，亚麻木酚素可以明显减轻CIH诱导的小鼠心肌损伤。

Fig 1 HE staining of mouse myocardium in each groupA:control;B:CIH;C:CIH+SDG

2.1.2亚麻木酚素对CIH小鼠心质量/体质量比值的影响 3组小鼠造模完成后的心质量/体质量比值计算结果。可见CIH处理组小鼠心质量低于常氧组，CIH组小鼠体质量明显低于常氧组(P<0.01)，而与常氧组相比CIH处理组小鼠心质量/体质量比值明显升高(P<0.05)，给予SDG后小鼠心质量/体质量比值下降(P<0.05)，见Tab 1。

Tab 1 Comparison of heart weight,body weight,heart weight / body weight of mice in each

2.1.3亚麻木酚素对CIH小鼠血清生化指标的影响 与常氧组相比，CIH组血清中LDH、CK的浓度明显升高(P<0.01)，而CIH+SDG组与CIH组相比明显降低(P<0.05)，见Tab 2。说明CIH造成了心肌细胞的破坏，LDH、CK释放入血，亚麻木酚素处理组小鼠血清中LDH、CK明显减低。

Tab 2 Measurement results of LDH and CK concentrations in mouse

2.2 亚麻木酚素对CIH小鼠心肌氧化应激的作用分别检测3组小鼠心肌组织匀浆中MDA、SOD的含量。与常氧组相比，CIH组小鼠心肌组织中MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD含量明显降低(P<0.01)。SDG干预可见MDA含量明显下降(P<0.05)，SOD含量明显升高(P<0.01),见Tab 3。说明CIH可以引起小鼠心肌氧化应激，且给予SDG后改善了CIH小鼠诱导的氧化应激。

Tab 3 Contents of MDA and SOD in myocardial tissues of rats in each

2.3 亚麻木酚素对CIH小鼠心肌炎症的作用

2.3.1亚麻木酚素对CIH小鼠血清中炎性因子的影响 3组炎症因子的比较，CIH组与常氧组相比，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β均明显升高(P<0.05)，而CIH+SDG组与CIH组相比TNF-α有非常明显的下降(P<0.01)，IL-6明显下降(P<0.05)，IL-β含量降低，见Tab 4。这说明CIH可造成小鼠血清中炎症因子升高，给予SDG后可以改善CIH诱导的小鼠全身性炎症反应。

Tab 4 Measurement results of serum inflammatory factors TNF-α,IL-6 and IL-1β in

2.3.2Western blot检测TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表达情况

2.3.2.1SDG对CIH小鼠心肌组织中TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表达情况的影响 结果见Fig 2，模型组与常氧组相比，小鼠心肌中TXNIP、NLRP3炎性小体(NLRP3、caspase-1和ASC)蛋白表达均明显升高(P<0.05)，给药组与模型组相比，TXNIP、NLRP3炎性小体(NLRP3、caspase-1和ASC)蛋白的表达均明显下降(P<0.05)。

Fig 2 The protein expression levels of TXNIP and NLRP3 inflammasomes in myocardial tissuesdetected byWestern blot in each *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs CIH

2.3.2.2SDG对CIH小鼠心肌组织中炎性因子IL-18和IL-1β蛋白表达情况的影响 结果见Fig 3，模型组与常氧组相比，IL-18、IL-1β蛋白表达明显升高(P<0.01)，给药组与模型组相比，IL-18明显降低(P<0.01)，IL-1β蛋白表达降低。

Fig 3 Expression of IL-18 and IL-1β protein in myocardial tissuesdetected by Western blot in each **P<0.01 vs control;##P<0.01 vs CIH

3 讨论

OSA是一种常见的慢性睡眠呼吸障碍性疾病，全球2%的中年女性和4%的男性受其影响[10]。现代医学对OSA一般采用药物治疗、口腔矫治器治疗、呼吸机持续气道正压通气治疗、外科手术治疗等。然而到目前为止，各种治疗措施疗效不十分理想。姚亮等根据中医理论将鼾症分为肺脾气虚型、血虚性、肾阴虚行、肾阳虚型，其中临床上以肺脾气虚证常见[11]。《本草图经》《本经逢原》《滇南本草》等医籍中提到亚麻籽 “味甘辛、性平、无毒，具有补虚、补阴、养血祛风” 的作用。现代研究中表明亚麻籽提取物SDG具有心血管保护作用[12-13]，且具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗血小板聚集、抗癌以及清除自由基的作用[1]。

CIH作为OSA的主要病理特征[14]，是引发包括心室重构、心肌缺血、心力衰竭在内的心肌损伤的独立危险因素。近年来有研究证实[15]，与间歇性低氧缺氧/再氧合过程类似的，心肌缺血/再灌注损伤导致氧化应激并产生大量的ROS释放，促使 TXNIP 与 NLRP3 相互结合激活心肌组织中NLRP3炎性小体促使IL-1β、IL-18表达水平升高，降低心脏功能，扩大梗死面积。然而，CIH是否通过ROS-TXNIP-NLRP3信号通路诱发心肌损伤，以及SDG是否通过调节ROS-TXNIP-NLRP3信号通路改善CIH诱发的小鼠心肌损伤目前尚不清楚。此外，氧化应激反应在CIH 诱发的心肌损伤中起着关键作用，一般通过检测脂质过氧化物的终产物MDA以及SOD反映氧化应激水平以及细胞损伤程度[15]。其中TXNIP在无应激状态时，TXNIP是抗氧化剂硫氧还蛋白(thioredoxin-1，Trx-1)的负调节因子，TXINP与Trx在胞核内结合。而在氧化应激条件下，Trx1-TXNIP复合物解离，TXNIP从胞核转位到胞质，进而与NLRP3受体结合并活化NLRP3受体，促进NLRP3炎性小体形成[6,16]。将小鼠暴露于间歇性低氧环境中35 d 后，监测到其MDA水平较正常对照组明显增加，其SOD水平明显下降，心肌组织中TXNIP蛋白表达明显升高。给予SDG后，与CIH组相比，MDA水平下降，SDG水平有所上升，心肌TXNIP蛋白表达降低。以上结果显示，CIH可以引起小鼠心肌氧化应激及TXNIP蛋白的表达升高，给予SDG后改善了CIH小鼠诱导的氧化应激反应，提示SDG可通过抑制ROS的产生从而减弱TXNIP在心肌组织中的表达。其中NLRP3炎性小体是由NLRP3、衔接蛋白ASC(凋亡相关的斑点样蛋白)和pro-caspase-1组合而成的一种多蛋白复合体，在细胞碎片和微生物产物等促炎因子刺激下组装而成，其可触发固有免疫防御并且与无菌的炎症反应有关。NLRP3炎性小体可通过活化caspase-1诱导促炎因子IL-1β和IL-18的成熟、释放，从而引起组织炎症反应[17]。我们研究发现，CIH 小鼠心肌组织中NLRP3炎性小体、IL-1β和IL-18蛋白表达增多，SDG可使CIH小鼠NLRP3炎性小体、IL-1β和IL-18蛋白表达降低，减轻了CIH小鼠心肌损伤。这些结果均表明SDG可通过调节ROS-TXNIP-NLRP3信号通路改善了CIH诱导的小鼠心肌损伤。