鸡豆黄素A抑制血管紧张素Ⅱ诱导的小胶质细胞活化及其机制的研究

韩俊辉，杨 丽，俞益桂，薛海霞，吴文宁，李维祖，尹艳艳

(安徽医科大学基础医学院药理学教研室,合肥 安徽 230032)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以中老年人为主体的神经退行性疾病，其病理学特征为黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神经元的凋亡和丧失[1]。迄今为止该疾病的发病机制尚不明确，在临床上没有可靠有效的治疗方法。研究表明：肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)可以通过血管紧张素1受体(angiotensin type 1 receptor，AT1R)在神经炎症、氧化应激和多巴胺能变性的发展中发挥重要作用[2]。不同的致病因素如衰老、神经毒素、促炎因子都可以导致RAS的激活，局部或旁分泌的RAS是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶的激活剂，并且参与氧化应激和炎症反应。这提示血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导小胶质细胞活化介导的神经炎症与PD的病程有密切的关系。

鸡豆黄素A(biochaninA，Bioch A)是异黄酮类植物雌激素，具有抗高血压[3]、抗细胞凋亡[4]，对AD小鼠模型具有保护作用[5]。课题组前期研究结果发现，Bioch A能抑制LPS诱导的BV2活化，主要是通过抑制氧化应激，减少炎症因子的释放。但是，关于鸡豆黄素A抑制小胶质细胞活化的机制尚未完全明确，本研究通过建立AngⅡ诱导小胶质细胞活化的体外模型，观察Bioch A抑制AngⅡ诱导小胶质细胞活化的机制。

1 材料

1.1 细胞株小鼠小胶质细胞(BV2)株(来自于中国医学科学院协和医科大学基础细胞中心细胞室)。

1.2 药品与试剂DMEM培养基：美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)：杭州四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、鸡豆黄素A(Bioch A)、过硫酸铵(AP)：美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)：北京中杉金桥生物技术有限公司；胰蛋白酶(Trypsin)、NO检测试剂盒、ROS检测试剂盒(DCFH-DA荧光探针法)、RIPA裂解液(弱)、青霉素-链霉素溶液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒：江苏碧云天生物技术研究所；PVDF膜：美国Millipore公司；甲醇：上海化学试剂公司；超敏感底物发光试剂盒：北京全品速生物科技有限公司；鼠抗β-actin抗体(AF5001)：北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗P47phox抗体(BS1846)、兔抗gp91phox抗体(BS9035)：美国Bioworld公司；兔抗ASC抗体(67824S)、兔抗Caspase-1抗体(NB100-56565)、兔抗IL-1β抗体(12426S)、兔抗TNF-α抗体(11948S)、兔抗IL-6抗体(12912S)：英国Abcam公司；兔抗NLRP3抗体(15101S)：美国CST公司。

1.3 主要仪器GR600A立式全自动蒸汽灭菌器：致微(厦门)仪器有限公司；CHL2FM3型倒置显微镜：日本Olympus公司；SpectraMax190型全波长酶标仪：美国Molecular Device公司；DHG-9070型恒温烘箱：三发(上海)科学仪器有限公司；4600 Mini型化学发光成像系统：殴翔科学仪器有限公司；IC 1000型Countstar自动细胞计数仪：睿钰(上海)生物科技有限公司；TGL-20M型全自动高速低温离心机：黑马(珠海)医学仪器有限公司；HealForce100型恒温培养箱：力康(香港)生物医疗科技有限公司；WH2型漩涡混合仪：泸西(上海)分析仪器厂。

2 方法

2.1 BV2细胞株的培养将BV2细胞接种于含10%血清(FBS)和1%青霉素和链霉素溶液的DMEM培养基中，然后将该培养瓶放置在5% CO2，37 ℃的恒温培养箱中培养。每隔2～3 d更换一次。待显微镜下观察到细胞占据培养瓶面积90%以上或细胞铺满瓶底时，即可进行细胞传代。使用Countstar自动细胞计数仪检测细胞数目。待在显微镜下观察到细胞长满80%～90%时，提前配制冻存液对处在对数生长期的增殖能力强的BV2细胞进行冻存。细胞复苏过程要尽量加快速度，以免冻存液中的DMSO在常温下杀伤细胞，影响实验结果。

2.2 AngⅡ剂量的筛选为了选择合适的AngⅡ造模浓度。试验将BV2细胞分成6组，分别为AngⅡ(0、25、50、100、200、400 nmol·L-1)组，除对照组外，其余每组加入相应浓度的AngⅡ，恒温箱中孵育24 h，再加入新鲜配制的MTT(0.5 g·L-1)37 ℃孵育4 h，4 h后用移液器吸去培养板中的上清液，将100 μL的DMSO加入每个孔中，振摇10 min，保证室温避光，使甲瓒充分溶解于DMSO中，用全自动酶标仪进行检测，波长为490 nm，应重复至少3次以上的实验。

2.3 NO的测定使用Griess法检测红色重氮化合物从而间接测定NO，试验将BV2细胞分成6组，分别为AngⅡ(0、25、50、100、200、400 nmol·L-1)组；除Control组外，其余各组均加入AngⅡ(100 nmol·L-1)恒温箱中培养24 h。最后收集每组细胞上清。用Griess试剂盒测定吸光度，并计算出各组NO含量。

2.4 ROS检测使用DCFH-DA探针法检测Bioch A对BV2激活后的ROS的表达水平。试验将BV2细胞分为7组，分别为Control组，AngⅡ(100 nmol·L-1)，Losartan(1 μmol·L-1)组，AngⅡ(100 nmol·L-1)+Losartan(1 μmol·L-1)组，AngⅡ+Bioch A(1.25 μmol·L-1)组，AngⅡ+Bioch A(2.5 μmol·L-1)组，AngⅡ+Bioch A(5 μmol·L-1)组，分别加上以上药物预处理2 h,除Control组和Losartan(1 μmol·L-1)外，其余各组均加入AngⅡ(100 nmol·L-1)孵育24 h。并在正置荧光显微镜下用DCFH-DA探针法采集相应图像，利用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析，检测各组平均荧光强度。

2.5 酶联免疫吸附测定(ELISA)收集细胞上清液：离心，去除颗粒和聚合物，按一次用量分装，冻存于-80 ℃冰箱中，避免反复冻融，确保样品在室温下解冻均匀。标准品的稀释：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品，每个浓度设两个空；加样：在酶标仪包被板上待测样本孔先加待测样本，再加样本稀释液；温箱温育：依次标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记过的检测抗体并盖上封板膜，37 ℃恒温箱温育60 min。洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，弃去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次，拍干。避光孵育显色：每孔分别加入底物A、B各50 μL，振摇混匀，37 ℃避光孵育15 min。终止测定：每孔加入终止液50 μL，空白孔调零，在450 nm波长处测定各孔的OD值。用ELISA试剂盒，分别测量TNF-α、IL-1β炎症因子的含量。

2.6 蛋白免疫印记法(Western blot)在培养好的细胞中加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取蛋白。BCA试剂盒定量后各组取适量样品按样品和蛋白上样缓冲液4 ∶1比例进行变性。将变性后蛋白加入进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，后用含5%的脱脂奶粉的TBST溶液进行室温封闭1 h，封闭好的膜用TBST洗3次，后将膜至于相应的一抗中4 ℃过夜。次日，TBST洗3次后，室温孵二抗1 h，结束后用TBST洗3次，再用增强化学发光法(ECL)，放入化学成像系统进行拍摄。蛋白条带用ImageJ软件检测光密度。

3 结果

3.1 AngⅡ剂量的筛选为了选择合适的AngⅡ造模浓度，我们采用MTT法检测细胞活力。Fig 1结果显示，当AngⅡ的浓度低于100 nmol·L-1时，实验组细胞的MTT值有逐渐升高的趋势；当AngⅡ的浓度大于100 nmol·L-1时，对MTT值进行比较，实验组低于Control，差异具有统计学意义(P<0.05)。此时AngⅡ对BV2细胞作用转变为损伤作用而不是激活作用，因此我们选取AngⅡ(100 nmol·L-1)诱导BV2细胞活化。

Fig 1 Effects of different concentrations of AngⅡ on BV2 cells *P<0.05 vs control group.

3.2 不同浓度的AngⅡ诱导小胶质细胞产生NO的影响采用Griess法检测各组细胞上清液中NO的含量，结果如Fig 2所示，与对照组相比较，当AngⅡ浓度为100 nmol·L-1时，细胞上清液的NO含量增加最多，且差异具有统计学意义(P<0.01)；当AngⅡ浓度大于100 nmol·L-1时，细胞上清液的NO含量出现下降，这时的AngⅡ对BV2细胞表现出严重的损伤，引起细胞凋亡。

Fig 2 Effects of different concentrations of AngⅡ on NO production in BV2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group.

3.3 Bioch A对AngⅡ诱导小胶质细胞活化产生ROS的影响采用DCFH-DA探针法，检测AngⅡ诱导的BV2细胞内的ROS荧光强度，并分析统计各组平均荧光强度，结果如Fig 3所示，与对照组相比较，AngⅡ组ROS荧光强度升高(P<0.01)；与AngⅡ组相比，Bioch A (5.0 μmol·L-1)组和losartan组ROS表达量降低(P<0.01)，Bioch A (1.25、2.5 μmol·L-1)组ROS的表达量变化差异无统计意义；Losartan组ROS表达水平未出现明显变化(P>0.05)；结果表明，加入Losartan阻断AT1R后可以降低细胞内ROS的表达水平，Bioch A能抑制AngⅡ诱导的BV2细胞内的ROS水平升高。

Fig 3 Effects of Bioch A on ROS production in

3.4 Bioch A对AngⅡ诱导小胶质细胞上清中TNF-α，IL-1β释放量的影响采用ELISA法检测AngⅡ诱导小胶质细胞激活后上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β的含量。结果如Fig 4所示，与Control组比较，AngⅡ组上清液中TNF-α、IL-1β含量上调(P<0.01)；与AngⅡ组比，Losartan组TNF-α、IL-1β含量下调(P<0.01)，Bioch A组(2.5 μmol·L-1)TNF-α、IL-1β含量下调(P<0.05)，而Losartan组TNF-α、IL-1β含量未出现明显差异(P>0.05)；上述结果表明，Bioch A可以抑制活化的小胶质细胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β含量的表达。

Fig 4 Effects of Bioch A on release of IL-1β and TNF-α **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs AngⅡ group.

3.5 Bioch A对AngⅡ诱导小胶质细胞AT1R的影响结果如Fig 5所示，与对照组相比，AngⅡ组细胞的AT1R蛋白表达量增多，且差异具有统计学意义(P<0.01)；与AngⅡ组相比较，Bioch A (1.25、2.5、5.0 μmol·L-1)组的AT1R蛋白的表达量未出现明显变化(P>0.05)。

Fig 5 Effects of Bioch A on the expression of AT1R in AngⅡ-induced BV2 cells1.Control group;2.AngⅡ(100 nmol·L-1)group;3.AngⅡ+Bioch A(1.25 μmol·L-1)group;4.AngⅡ+Bioch A(2.5μmol·L-1);5.AngⅡ+Bioch A(5 **P<0.01 vs control group.

3.6 Bioch A对AngⅡ诱导小胶质细胞gp91phox、P47phox蛋白的影响结果如Fig 6所示，与Control组比较，AngⅡ组蛋白表达水平上调(P<0.01)；与AngⅡ组比较，Losartan组蛋白水平下调(P<0.01)，Bioch A(2.5 μmol·L-1组蛋白水平下调(P<0.05)。结果表明，Bioch A能抑制AngⅡ诱导的小胶质细胞gp91phox、P47phox蛋白表达。

Fig 6 Effect of Bioch A on gp91phox,P47phox induced by AngⅡ in A:gp91phox protein expression B:P47phox protein expression.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs AngⅡ group.

3.7 Bioch A对AngⅡ诱导小胶质细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响结果如Fig 7所示，与Control组比较，AngⅡ组蛋白表达水平含量上调(P<0.01)；与AngⅡ组比，Losartan组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平下调(P<0.01)，Bioch A组蛋白水平下调(P<0.05)，而Losartan组TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达未出现明显差异。结果表明，Bioch A可以抑制活化的小胶质细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表达。

Fig 7 Effect of Bioch A on IL-1β,IL-6,TNF-α protein expression in microglial cells induced by A:IL-1β protein expression;B:IL-6 protein expression;C:TNF-α protein expression.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs AngⅡ group.1:Control;2:AngⅡ;3:Losartan;4:AngⅡ Losartan;5:AngⅡ Bioch A

3.8 Bioch A对AngⅡ诱导小胶质细胞ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白表达的影响结果如Fig 8所示，与Control组比较，AngⅡ组蛋白表达水平上调(P<0.01)；与AngⅡ组比，Losartan组ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白水平下调(P<0.01)，Bioch A组ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白水平下调(P<0.05)；结果表明，Bioch A可以抑制活化的小胶质细胞中，ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白的表达。

Fig 8 Effects of Bioch A on the levels of ASC,Caspase-1 and NLRP3 in AngⅡ-induced BV2 A:ASC protein expression;B:Caspase-1 protein expression;C:NLRP3 protein expression.**P<0.01 vs control group;##P<0.05,#P<0.01 vs AngⅡ group.1:Control;2:AngⅡ;3:Losartan;4:AngⅡ Losartan;5:AngⅡ Bioch A

4 讨论

研究发现，PD患者的黑质致密部血管紧张素Ⅱ水平高，提示DA能神经元的凋亡可能与AngⅡ水平高有关。RAS主要存在于循环系统，调节血容量和水盐平衡。本实验中采用AngⅡ诱导小胶质细胞活化的体外模型，观察Bioch A抑制AngⅡ诱导小胶质细胞的活化的机制。不同浓度AngⅡ处理细胞，结果显示，AngⅡ(100 nmol·L-1)诱导BV2细胞活力最强，因此本实验选用AngⅡ(100 nmol·L-1)用于后续造模。

神经炎症在PD的病理进程中起着重要的作用[6]，它参与线粒体损伤、氧化应激等过程，甚至是PD相关蛋白基因的表达。小胶质细胞在受到免疫炎性因素等刺激或者微环境因子发生变化时，迅速地被激活，同时活化的小胶质细胞释放大量包括NO、ROS、TNF-α和IL-1β等促炎因子或毒性物质，如果这些促炎因子或毒性物质不停地释放，将会导致神经元变性甚至死亡。

AngⅡ作为RAS最重要的效应物，与AT1R相互作用，激活NADPH氧化酶复合物，进而介导氧化应激和炎症的几个关键环节。在PD动物模型中，我们观察到AngⅡ通过AT1R提高了黑质NADPH氧化酶的活性[7-8]。此外，其他研究表明，小胶质细胞激活和NADPH衍生自由基在多巴胺能神经损伤中起主要作用，可能在PD中起重要作用[9-10]。小胶质细胞的激活可能在AngⅡ诱导的PD模型中增强多巴胺能细胞死亡中起关键作用[11-12]。

NLRP3炎症小体的激活主要通过3种模式，其中一种模式和NADPH氧化酶相关的ROS的生成增加有关。有相关研究表示，线粒体中的ROS是调控NLRP3炎症小体活化的关键信号[13-15]。在本实验中，AngⅡ诱导小胶质细胞活化，产生ROS，进而增加NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达。NLRP3炎症体的激活可以调控炎症因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)的增加。说明AngⅡ可能跟通过NLRP3炎症小体促进小胶质细胞的活化，促进炎症因子的释放，参与神经炎症的发生发展。当给予Bioch A后，小胶质细胞的活化被抑制，NLRP3炎症体的活化被抑制，炎症因子的释放也被抑制。

综上所述：Bioch A可以有效抑制AngⅡ诱导小胶质细胞活化，且Bioch A可能通过NLRP3炎症小体抑制小胶质细胞的活化，也为以后植物雌激素治疗PD提供新的研究方向。