海南东寨港红树林内生真菌Aspergillus fumigatus SAS10吡喃酮类代谢产物*

郭思雨，邹庭光，朱静琳，林慧美，许婉毅，黄洪波，陶移文

（广州医科大学药学院分子靶标和临床药理重点实验室/广州医科大学附属第五医院，广东广州511436）

红树林内生真菌作为海洋真菌的第二大生态群落，因其独特的生存环境造就了耐碱和耐盐的生理特性，从而产生了多种陆源内生真菌所没有的结构多样和活性良好的新颖代谢产物［1］。红树林内生真菌的代谢产物为各种新颖抗生素、抗真菌药、免疫抑制剂和抗癌药等先导化合物的发现做出了重大贡献［2-3］。烟曲霉（Aspergillus fumiga⁃tus） 属于丝孢菌纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Hyphomycetales）、曲霉属（Aspergillus）真菌［4］，其产生的有些代谢成分会造成人类和动物的肺部真菌疾病［5］，该菌属分布世界各地，土壤、腐败有机物内均可繁殖，并且生存适应度高、繁殖能力强、代谢产物多样［6］。据文献报道，从烟曲霉中产生的具有良好活性的次级代谢产物已经超过220 多种［7］，其主要的代谢产物有喹啉类衍生物、二酮哌嗪类衍生物、生物碱类和烟曲霉素类等［8］。毗喃酮类化合物广泛存在于植物和微生物中，其抗肿瘤活性和抗菌活性突出［9］，因此受到研究者的关注［10-12］。本课题组对分离自海南省东寨港自然保护区红树植物无瓣海桑Aspergillus fumigatus⁃SAS10进行了发酵，并对其代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定工作，获得了5个毗喃酮类化合物和两个酯类化合物。所得7个化合物首次报道为烟曲霉次级代谢产物，丰富了烟曲霉代谢产物的种类。

图1 化合物1～7的结构Fig. 1 The structure of compounds 1-7

1 仪器与材料

超净工作台（苏州苏洁净化有限公司，SJ-CJ-2FDQ 型）；高压蒸汽灭菌锅（日本松下健康医疗器械株式会社，MLS-3781L-PC）；旋转蒸发仪（上海霄汉实业发展有限公司）；薄层色谱硅胶HS-GF254（青岛海洋化工厂有限公司）；色谱纯乙腈（瑞典Oceanpak 公司）；JNM-ECZ 400NB核磁共振波谱仪（日本电子株式会社）；6460 三重四级杆液质联用质谱（美国Agilent 公司）；Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；半制备色谱柱Sharpsil-AQ C-18， 250*10.0 mm ID S-5 μm（上海煊美实业）。菌株SAS10 采自海南东寨港红树林，通过用真菌ITS 引物ITS1 和ITS4 扩增真菌18S DNA 序列，所得到的序列在GeneBank 中用Blast 进行进化树相似性分析，鉴定为Aspergillus fumigatus 该菌种现保存于广州医科大学药学院。

2 发酵、提取与分离

菌株Aspergillus fumigatus SAS10 用大米培养基在常温下进行发酵，培养基配方为1 L 三角瓶装大米85 g，加质量质量浓度为2 g/ L 的粗海盐溶液160 mL，经121 ℃灭菌20 min 后接入种子液5 mL，静置培养40 d。发酵产物用等量甲醇浸泡48 h，取上清液旋蒸至无甲醇，重复5次，将提取液浓缩至5 L 后，再用等体积的乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯部位，旋干得乙酸乙酯得粗提物。粗提物经硅胶（200～300 目）柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯（体积比为100∶0，80∶20，67∶33，50∶50，33∶67，20∶80，0∶100）系统等度洗脱，每个等度为三倍柱体积，相应获得7 个（Fr.A-Fr. G）不同极性段的组分。各组分经检测后，对Fr. D 通过半制备HPLC 进行分离，流动相为乙腈-水体积比为60∶40 等度洗脱，流速2 mL/min，得到化合物3 和6；将Fr.F 通过半制备HPLC 进行分离，流动相为乙腈-水体积比为60∶40 等度洗脱，流速2 mL/min，得到化合物5；将Fr.H进行正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（体积比为50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100）梯度洗脱，相应获得组分Fr. H1-H6。对其中的Fr. H1、Fr. H2、Fr. H3、Fr. H4 分 别 用 半 制 备HPLC 进行分离，流动相分别为乙腈-水，体积比为100∶0、30∶70、30∶70 和25∶75，流速均为2 mL/min，相应得到化合物7、1、2和4。

3 结果与分析

3.1 菌株鉴定

菌株SAS10 经18S DNA 序列测定，测序结果如下。GGGGCTTCTACTGATCGAGGTCACCTTAGAAAAA TAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCT ACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGG ACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCG TCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACAC AAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGAC AGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATG TGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGC AATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTC ATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAA GTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCA TACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGG CGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGG CGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAAGCAACA AGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCA GAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGT TCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTTACTTC CA

将菌株SAS10与NCBI数据库进行比对后，选择数据库中具有较高序列相似性的已有序列进行BLAST，并使用MEGA7.0构建进化树（图2）。进化树结果表明SAS10属于Aspergillus fumigatus。

3.2 结构鉴定

图2 SAS10的进化树Fig. 2 The evolutionary tree of SAS10

化合物1：黄色粉末，24.0 mg。ESI-MS：m/z 187.2［M+H］+，结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C12H10O2，不饱和度为8。详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.07（d，J = 5.7 Hz，1H），7.38～7.25（m，5H），6.22（dd，J = 5.8，2.4 Hz，1H），6.18（d，J = 2.4 Hz，1H），3.89（s，2H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：177.9，168.1，156.5，135.7，129.0（2C），128.7（2C），127.1，115.9，114.8，38.8。与文献［13］数据基本一致，故化合物1鉴定为aspergyllone。

化合物2：白色不定型粉末，3.4 mg。ESIMS：m/z 203.1［M+H］+，［α］20D= +76.6（0.1 mol/L，CH3OH），结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C12H10O3，不饱和度为8。详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.05（d，J = 5.8 Hz，1H），7.43～7.28（m，5H），6.42（d，J=2.6 Hz，2H），6.21（dd，J=5.8，2.6 Hz，1H），5.48（d，J=2.3 Hz，1H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz ）δ：177.7，169.9，156.1，140.3，128.3（2C），127.9，126.6（2C），116.0，112.0，71.0。与文献［14］数据基本一致，故化合物2 鉴定为（R）-2-（hydroxy（phenyl）methyl）-4H-pyran-4-one。

化合物3：黄色粉末，5.2 mg。ESI-MS： m/z 230.1［M+H］+，结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C13H11NO3，不饱和度为9。详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.79（s，1H），8.55（s，1H），7.77（s，1H），7.38～7.28（m，5H），6.43（s，1H），3.98（s，2H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：177.7，168.8，163.0，162.2，135.3，129.1（2C），128.8（2C），127.3，119.3，115.5，38.3。与文献［15］ 数据基本一致，故化合物3鉴定为carbonarone A。

化合物4：棕色粉末，1.9 mg。ESI-MS：m/z 262.1［M+Na］+，［α］20D=-37.2（0.1 mol/L，CH3OH），结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C12H17NO4，不饱和度为5。详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.26（d，J = 8.2 Hz，1H），6.09（d，J = 2.2 Hz，1H），5.57（d，J =2.2 Hz，1H），4.34（t，J = 8.2 Hz，1H），3.80（s，3H），1.88（s，3H），0.88（d，J = 6.8 Hz，3H），0.82（d，J=6.8 Hz，3H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz ）δ：170.8，169.4，163.9，163.3，99.8，87.9，56.5，56.2，29.9，22.4，19.2，18.4。与文献［16］数据基本一致，化合物4 鉴定为campy⁃rone A。

化合物5：黄色粉末，3.5 mg。ESI-MS：m/z 254.1［M+H］+，［α］=-17.3（0.1 mol/L，CH3OH），结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C13H19NO4，不饱和度为5。详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.28（d，J = 8.5 Hz，1H），6.09（d，J = 2.2 Hz，1H），5.56（d，J =2.2 Hz，1H），4.39（t，J = 8.5 Hz，1H），3.80（s，3H），1.86（d，J = 3.2 Hz，3H），1.83～1.75（m，1H），1.45（m，1H），1.17～1.06（m，1H），0.83（t，J=7.4 Hz，3H），0.78（d，J=6.8 Hz，3H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz ）δ：170.7，169.3，163.9，163.3，99.9，87.9，56.4，54.9，36.0，24.6，22.4，15.5，10.8。与文献［16］数据基本一致，化合物5鉴定为campyrone C。

化合物6：黄色油状，4.7 mg。ESI-MS： m/z 235.1［M+Na］+，结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C11H16O4，不饱和度为4。详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：4.36（s，1H），3.37（s，2H），2.40（t，J=7.5 Hz，2H），1.99（s，3H），1.51～1.45（m，2H），1.43 ～1.35（m，2H），1.32～1.26（m，4H）；13C NMR（DMSOd6，100 MHz）δ：166.5，166.3，143.5，140.9，60.6，32.4，28.5，27.0，25.2，23.6，9.3。与文献［17］ 数 据 基 本 一 致， 化 合 物6 鉴 定 为asperfurandione A。

化合物7：棕色油状，3.1 mg。ESI-MS： m/z 279.1［M+H］+，结合13C NMR 和1H NMR 数据，推断其分子式为C16H22O4，不饱和度为6，详细核磁数据如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.71（m，2H），7.66（m，2H），4.28～4.16（m，4H），1.70～1.59（m，4H），1.43～1.31（m，4H），0.91（t，J = 7.4 Hz，6H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz） δ：166.9，131.7，131.5，128.6，65.0，30.0，18.6，13.5。与文献［18］数据基本一致，化合物7鉴定为dibutylterephthalate。

4 结果和讨论

对红树林植物无瓣海桑的内生真菌Aspergillus fumigatus SAS10进行发酵，从其发酵粗提物中共分离并鉴定7 个化合物，5 个毗喃酮类和两个酯类化合物，说明该菌株有很大产生毗喃酮类化合物的潜力。文献报道，该类化合物对多种致病菌和肿瘤细胞有较好的抑制活性，如化合物1对热带念珠菌（Candida tropicalis）、近平滑念珠菌（ATCC 22019）有中等强度的抗真菌活性［13］；化合物3 对白色念珠菌（Candida albicans）有中等强度的抑菌活性，对克鲁斯念珠菌（Candida krusei）有较强的抑制活性，也显示出对植物病原性细菌（Dickeya solani van der Wolf）具 有 一 定 的 抑 制 活 性［13］；同时，化合物1 和2 对人体胰腺癌细胞表现出中等强度的抑制活性［14］，化合物3 对K562 细胞有中度抗增殖活性［15］；化合物6 显示对芽孢杆菌、新型隐球菌和白色念珠菌有中等抑菌活性［17］。7个化合物首次报道为南海红树林内生真菌烟曲霉次级代谢产物，为毗喃酮类化合物的获取提供了新来源。后续，我们将继续挖掘红树林内生真菌的抗肿瘤、抗菌等活性物质，获得新的药物先导化合物。