□ 李婷婷 刘月月 魏 滨 淄博市疾病预防控制中心
对无机砷的检测方法主要有液相色谱—原子荧光联用法、原子荧光法、高效液相色谱—氢化物—原子荧光联用法。液相色谱—原子荧光光谱法(LC—AFS)灵敏度高,检出限低,是GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中的推荐方法,以亚砷酸盐[As(Ⅲ)]和砷酸盐[As(Ⅴ)]含量的加和来计算大米中无机砷的含量。本实验在国家标准方法的基础上,优化了光电倍增管电压、载流液浓度等条件,并用优化后的条件对本地市售大米中的无机砷进行检测。
SAP—20 液相色谱—原子荧光联用仪(HG—AFS)(北京吉天仪器有限公司);阴离子交换柱:CNWsep AX HPLC Column(250 mm×4.0 mm,10 μm)。
氢氧化钾、硼氢化钾、磷酸二氢铵、盐酸、氨水,均为分析纯,购置于国药集团化学试剂有限公司;硝酸(北京化学试剂研究所);甲醇,色谱纯,德国Merck;亚砷酸根溶液标准物质(GBW 08666),定值浓度ρ(AsO33—)=(1.011±0.016)μmol/g,定 值单位为中国计量科学研究院;砷酸根溶液标准物质(GBW 08667),定值浓度 ρ(A sO 43—)=(0.233±0.005)μmol/g,定值单位为中国计量科学研究院[1]。
1.3.1 原子荧光检测条件
总电流(mA):90;辅电流(mA):45;负高压(V):290;原子化器高度(mm):8;载气流量(mL/min):400;屏蔽气流量(mL/min):600;载流:7%盐酸;还原剂:2% KBH4+0.35% KOH。
1.3.2 液相色谱条件
流动相:磷酸二氢铵(15 mmol/L);流动相流速:1.2 mL/min;进样量:100 μL。
称取约1.0 g 磨碎混匀后的大米粉(准确至0.001 g)于50 mL 塑料离心管中,加入20 mL 0.15 mol/L 的硝酸溶液,放置过夜。90 ℃恒温箱中浸提2.5 h,每0.5 h 振摇1 min。提取完全后,取出冷却至室温,8 000 r/min 离心15 min,取上清液,经0.45 μm 有机滤膜过滤后进样测定。同时以相同操作方法作空白试验。
还原剂采用2% KBH4+0.35%KOH 溶液,配置2%、7%、和10%的盐酸,测试确定盐酸的最佳浓度。检测样品均采用ρ(As3+)=1.00 mg/L、ρ(As5+)=1.00 mg/L 的混合标准溶液。试验结果表明,盐酸浓度增大,检测灵敏度随之提高,当浓度为7%时,灵敏度达到最大,盐酸浓度越大,反应越剧烈,生成氢气增多从而出现大量泡沫。测试发现,盐酸浓度大于7%后待测成分的检测灵敏度开始下降,相对偏差较大。即在还原剂采用2%KBH4+0.35% KOH 溶液的条件下,盐酸浓度为7%时检测灵敏度最大,盐酸浓度过高或过低时灵敏度均会减小,因此,在采用2% KBH4+0.35% KOH溶液为还原剂的条件下,盐酸的浓度应选7%[2]。
在原子荧光检测器中,检测灵敏度会受到空心阴极灯电流、光电倍增管电压、载气及屏蔽气流量的影响,采 用ρ(As3+)=1.00 mg/L、ρ(As5+)=1.00 mg/L 的混合标准溶液作为待测样品,测试原子荧光检测器主要参数的优化条件。
2.2.1 光电倍增管高压
光电倍增管可放大检测到的荧光信号,其放大倍数由负高压的大小决定。实验发现,当光电倍增管负高压较小时,荧光信号较弱,谱峰强度较低,仪器灵敏度较低;当负高压增大时,仪器灵敏度升高,各种形态的砷化物的谱峰强度增大。当负高压不断增大时,荧光信号强度不稳定。实验证明,光电倍增管负高压为290 V 时,信噪比最大,信号强度较高,本底值也较低,因此290 V 为最佳值。
2.2.2 载气流速优化
载气会影响原子化效率及氩氢火焰的稳定性,信噪比的大小也因此受到影响。当载气流速较小时,氩气吹扫能力不足,因此被测物氢化气吹扫速度低,谱峰强度低,信噪低;当氩气流量不足时,反应生成的氢气流量不稳定,导致氩氢火焰不稳定,信噪比较低。随着载气流量的增大,吹扫速度过快,待测元素氢化物原子化不完全就被排出,谱峰面积开始减小,载气流速越快,峰面积越小。实验发现,当载气流速为400 mL/min 时,谱峰面积最大,吹扫速度适中,氩氢火焰稳定,噪声较小,所以400 mL/min为最佳载气流速。
As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的标准色谱图见图1。配制砷酸盐、亚砷酸盐浓度为0、5、20、30、50、100 μg/L与200 μg/L的标准系列溶液,在上述优化条件下进行测定,其图谱如图1 所示。计算其标准曲线,以3 倍信号噪声比作为方法的检出限,结果见表1。由表中数据可以看出,实验条件下砷酸盐、亚砷酸盐的线性良好,检出限满足实验要求。
图1 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)标准谱图
表1 标准曲线方程及检出限
称取12 份1 g 粉碎后的大米粉,向其中6 份加入ρ(As3+)=1.00 mg/L、ρ(As5+)=1.00 mg/L 的 混 合 标 准 溶液0.2 mL,另6 份中加入混合标准溶液1.0 mL,用0.15 mol/L 硝酸溶液定容至20.0 mL。即加标浓度分别为0.4 mg/kg 和2.0 mg/kg。按照试验方法步骤处理后上机测定,实验结果列于表2 中。根据测定结果计算,低浓度与高浓度的加标回收率为:As(Ⅲ)97.5%~102.0%、As(Ⅴ)95.0%~101.4%,实验结果满足要求。
从超市、农贸市场及粮店共采集20 份大米,用液相色谱—原子荧光光谱法在本实验优化条件下进行检测。按照1.4 所示方法进行处理,20 份样品均未检出As(Ⅴ);As(Ⅲ)的检出浓度范围为0.027 ~0.077 mg/kg,检出率为75%。我国《食品中污染物限量标准》(GB 2762—2005)中规定大米中无机砷的限量值为0.15 mg/kg,本实验检测的本地大米样品中无机砷含量范围在0.027 ~0.077 mg/kg,以三价砷为主,所测样品均未超过限量标准。
表2 加标回收率及相对标准偏差
表3 大米中无机砷的检测数据
本次试验中,高效液相色谱的流动相采用磷酸二氢铵(15 mmol/L),流速为1.2 mL/min;氢化物发生系统参数条件为:还原剂为2% KBH4+0.35%KOH,载流为7%(v/v)盐酸,二者蠕动泵转速均采用120 r/min;载气流速400 mL/min,屏蔽气流速600 mL/min。在优化条件下,在0 ~200 μg/L 范围内,混合标准溶液的标准曲线的相关系数均优于0.999 5;检测限As(Ⅲ)、As(Ⅴ)检出限均为0.02 mg/kg;回收率试验结果满意。GB 5009.11—2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》中,第二篇 食品中无机砷的测定中的第一法液相色谱—原子荧光光谱法(LC—AFS)在优化后的条件下可准确测定无机砷。