HPLC法快速测定艾附暖宫丸中α-香附酮的含量

★ 王丽琼（乐山市食品药品检验检测中心 四川 乐山 614000）

艾附暖宫丸主治理气补血，暖宫调经。用于子宫虚寒，月经量少，经期腹痛，腰酸带下，用于子宫内膜异位症和宫内感染［1-2］。由艾叶、醋香附、当归、制吴茱萸、川芎等十味药材制成，有小蜜丸和大蜜丸两种规格。醋香附为臣药，处方用量最大，香附为莎草科莎草属植物莎草的干燥根茎，主要成分为挥发油，α-香附酮是主要有效成分之一，可作为艾附暖宫丸的特征性成分。《中国药典》2015年版一部中“艾附暖宫丸”［3］项下只采用α-香附酮对照品薄层鉴别，含量测定项下只控制了芍药苷，比较单一，不符合中药多指标控制的要求。参阅相关文献，曹玫等对不同产地香附中总黄酮含量进行比较研究［4］，赵昕等采用α-香附酮定性鉴别香苏胃痛胶囊中香附药材［5］，李道明等采用HPLC法测定舒筋活血片中山奈素、4-甲氧基水杨醛和α-香附酮的含量［6］，有采用HPLC法测定艾附暖宫丸中芍药苷、阿魏酸［7］和吴茱萸次碱［8］的含量，还有采用离子色谱法测定艾附暖宫丸中9种无机阴离子的含量［9］，还有采用 GC 法测定 α- 香附酮的含量［10］，未见HPLC法控制艾附暖宫丸中α-香附酮的含量。为了有效控制含香附制剂质量，本文采用超声直接提取，HPLC法快速测定艾附暖宫丸中α-香附酮的含量，为更全面控制其质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260高效液相色谱仪，DAD检测器（美国Agilent）；XS205梅特勒-托利多电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多，十万分之一）；CQ-100B超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）。

1.2 试药 α-香附酮对照品（110748-201513，中国食品药品检定研究院，99.7%）；艾附暖宫丸（市售，A厂，批号分别为20181203，20190101，20180101（大蜜丸）；B厂，批号为12181001）；甲醇（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；磷酸（分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司）；试验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：waters XTerra C18（5μm，250mm×4.6mm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）；检测波长：249nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品α-香附酮23.29 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇使溶解并稀释至刻度，即得对照品贮备溶液；精密吸取对照品贮备溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品小蜜丸，粉碎，取约3 g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 空白试验 按处方比例制备不含醋香附的阴性样品，并按“2.3”方法制备阴性样品溶液。取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样分析，根据保留时间和紫外光谱图定性，液相色谱图见图1，α-香附酮与相邻峰分离度大于1.5，阴性样品溶液在对照品溶液α-香附酮峰位置无色谱峰出现，其他共存成分无干扰。

图1 对照品溶液（A）、艾附暖宫丸（B）和阴性样品（C）色谱图

2.5 线性与范围 精密吸取对照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性第一点溶液；分别精密吸取对照品贮备溶液0.5、1、2、4、8 mL，分别置25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得线性系列浓度溶液；照“2.1”色谱条件测定峰面积。以浓度C（μg/mL）为横坐标，相应峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=33.880C+ 0.619，r= 1.0000。表明α-香附酮在0.93～74.30μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度 精密吸取“2.2”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD为0.9%（n= 6），表明精密度符合要求。

2.7 重复性 取批号为20181203的艾附暖宫丸，照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果艾附暖宫丸中α-香附酮的质量分数为0.156mg/g，RSD（n=6）为1.7%，表明重复性良好。

2.8 加样回收率 取批号为20181203的艾附暖宫丸粉末约1.5g，共6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品贮备液1 mL，按“2.3”方法提取，照“2.1”色谱条件测定6份供试品溶液的α-香附酮含量，计算加样回收率，见表1。α-香附酮平均加样回收率为98.9%，RSD 1.1%。

表1 回收率试验结果（n=6）

2.9 溶液的稳定性 精密吸取“2.7”项下的艾附暖宫丸溶液，室温，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样10μL，记录峰面积。结果艾附暖宫丸中RSD（n=7）为0.4%，表明样品溶液在24h内稳定。2.10 含量测定 精密称取4批艾附暖宫丸样品，每批平行测定3份，照“2.3”方法制备样品溶液，照“2.1”色谱条件测定，采用外标法计算，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

采用紫外-可见分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描，α-香附酮在249 nm波长处有最大吸收，且其他成分在此无干扰，所以选择249 nm波长为测定波长。

实验中比较了浸泡+超声处理、直接超声处理对α-香附酮提取效果的影响，两者结果相似，最后采用较简便的直接超声提取方法。

醋香附是艾附暖宫丸的主要成分之一，其原质量标准未对其质量指标α-香附酮含量进行控制。本实验采用HPLC法测定其α-香附酮的含量，通过对4个批次样品共2个规格（小蜜丸和大蜜丸）进行检验，表明方法专属性强，重复性好，准确度高，简单快速，可作为艾附暖宫丸的含量测定方法。本文涉及的4个批次艾附暖宫丸中，α-香附酮的含量为0.087～0.157 mg/g，质量稳定，可考虑收集更多的样本，制定控制艾附暖宫丸中α-香附酮的质量标准。