内源性尿素对化学发光法检测TgAb、TPOAb和TSH的干扰研究

李立和，孙国忠，张 超

（天津医科大学宝坻临床学院检验科，天津 301800）

化学发光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的检测技术[1]，主要用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测，但检测过程中常受到内源性物质（类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶）、外源性因素（细菌污染、溶血、储存时间）和其他物质（尿素、治疗性抗体、生物素）的干扰[2]。本研究拟探讨内源性尿素对CLIA检测结果的干扰。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取天津医科大学宝坻临床学院透析室的肾功能衰竭患者30例，其中男18例、女12例，年龄32～62岁。另选取天津医科大学宝坻临床学院体检健康者45名，其中男23例、女22例，年龄25～65岁。

1.2 试剂与仪器

尿素（相对分子质量60.06，分析纯，批号180620）购自上海展云化工有限公司，尿素酶（20 KU，批号L2659Y70919）购自上海源叶生物科技有限公司。TG328A型分析天平购自上海市分析天平二厂。采用ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪（德国西门子公司）及配套试剂（CLIA）检测甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TgAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）和促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH），试剂批号分别为38636326、70608276、59465335。采用AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）及配套试剂（速率法，试剂批号为20190311）检测血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.3 方法

分别采集30例肾功能衰竭患者透析前、后的静脉血3.0 mL，离心分离血清，用于检测TgAb、TPOAb和TSH浓度。取体检健康者的混合血清，检测TgAb、TPOAb、TSH和BUN浓度，随后加入不同浓度（20、10、30、40、50、60 mmol/L）尿素，再次检测TgAb、TPOAb、TSH和BUN浓度。根据文献[3]中的酶动力学方程及尿素转化率、作用时间、米氏常数、尿素浓度等计算出加入肾功能衰竭患者血清中的尿素酶浓度为800 U/L，加入尿素酶后分别检测患者透析前、后血清TgAb、TSH和TPOAb浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用配对t检验。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Wilcoxon符号秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb和TSH浓度的比较

肾功能衰竭患者透析后血清TgAb、TPOAb和TSH浓度高于透析前（P<0.001）。见表1。

表1 肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb和TSH浓度的比较

2.2 TPOAb<15.0 IU/mL、TgAb<15.0 IU/mL的患者透析前、后TPOAb、TgAb项目发光值的比较

TPOAb<15.0 IU/mL、TgAb<15.0 IU/mL的患者透析前、后TPOAb、TgAb项目的发光值差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 TPOAb＜15.0 IU/mL、TgAb＜15.0 IU/mL的患者透析前、后TPOAb、TgAb项目发光值的比较 ×105 RLU

2.3 体检健康者混合血清加入不同浓度尿素前后TgAb、TPOAb、TSH、BUN浓度的变化

在体检健康者混合血清中加入不同浓度的尿素。与加入尿素前比较，加入尿素后TgAb、TPOAb、TSH浓度随尿素浓度的升高而逐渐降低，BUN浓度逐渐升高。见表3、图1。

表3 体检健康者混合血清加入不同浓度尿素前后TgAb、TPOAb、TSH、BUN浓度的变化

图1 不同浓度尿素对CLIA测定TgAb、TSH、TPOAb发光值的干扰作用

2.4 加入尿素酶后肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH浓度的变化

加入800 U/L尿素酶后，肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH浓度差异均无统计学意义（P>0.05）。

表3 加入尿素酶后肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH浓度的变化 ±s

表3 加入尿素酶后肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH浓度的变化 ±s

TPOAb/（IU/mL）透析前 26 46.20±7.24 3.21±1.68 62.10±6.23透析后 26 45.90±7.31 3.18±1.72 62.45±6.50 t值 -0.496 -0.389 -0.408 P值 0.622 0.256 0.686组别 例数 TgAb/（IU/mL）TSH/（mIU/mL）

3 讨论

CLIA具有灵敏度高、特异性强、易于自动化等优点，因而在临床实验室中得到广泛应用。有研究结果显示，在干扰实验（6、7、8 mol/L尿素分别反应5 min，7 mol/L尿素反应10 min）中，尿素对测定结果的干扰可达19%～31%[4]。健康人的血清尿素浓度为3.1～8.0 mmol/L，而肾功能衰竭患者血清尿素浓度为17.9～70.0 mmol/L[5]，因此肾功能衰竭患者体内的内源性尿素极易对CLIA的相关检测结果造成干扰。

本研究结果显示，双抗体夹心法检测TgAb、TSH、TPOAb的浓度随尿素浓度的升高而降低；肾功能衰竭患者透析后血清TgAb、TPOAb和TSH浓度高于透析前（P<0.001），且随着尿素浓度的升高，TgAb、TPOAb、TSH项目的发光值出现明显变化。在TPOAb<15.0 IU/mL、TgAb<15.0 IU/mL的透析患者中，由于无TgAb、TPOAb参与抗原-抗体偶联发光物的反应，尿素不影响TgAb、TPOAb测定的发光值，因此透析前、后TPOAb、TgAb项目发光值差异均无统计学意义（P>0.05）。由于本研究的肾功能衰竭患者无极低值TSH，因此未对极低值TSH进行尿素干扰实验。另外，考虑到三碘甲状腺原氨酸与游离三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素与游离甲状腺素间会相互转化，因此本研究也未对这4个项目进行尿素干扰实验。有研究结果显示，在感染类项目，如乙型肝炎表面抗体的CLIA检测中，一般将血清样本稀释10～100倍后再进行检测，因此内源性尿素基本不会产生干扰。本研究结果显示，加入尿素酶后，肾功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH浓度差异均无统计学意义（P>0.05），提示尿素酶可以消除内源性尿素的干扰，进一步证实尿素会对CLIA检测产生干扰。

抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，使分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同，互补程度高，则亲和力强。抗原抗体结合是一种非共价键结合，维系这种结合是静电引力、范登华力、氢键和疏水键共同作用的结果，使抗原抗体结合稳定并存在解离的可逆性。本研究结果显示，在血清中加入高浓度尿素后，尿素分子与抗体肽链形成氢键的能力比水分子强，尿素分子中氢原子与抗体肽链中的氧原子作用而形成氢键，能破坏抗体蛋白质分子内部氢键，使抗体肽链中靠氢键维系的二级结构，如螺旋、折叠、自由回转结构遭到破坏，进而降低蛋白质非极性基因与水的疏水作用，导致抗原抗体间的氢键、疏水作用大大降低，使低亲和力抗体与抗原结合的互补程度差而发生解离，从而被洗涤液洗脱；高亲和力抗体因与抗原结合互补程度高，尿素对其的影响小，所以未被洗脱液洗脱[4，6-7]。由此可见，尿素通过干扰抗原-抗体的结合强度和结合率而影响发光物的偶联数量，使发光值及检测结果发生改变。

尿素酶常作为测定血清尿素氮的工具酶，血清中的尿素在尿素酶的作用下，水解生成氨和二氧化碳。在CLIA反应过程中，当血清被加入到含有尿素酶的稀释液中时，血清中的尿素在尿素酶的作用下，水解生成氨和二氧化碳，使血清中的尿素无法干扰抗原-抗体的结合，从而保持反应的稳定[8]。

综上所述，较高浓度的内源性尿素会干扰CLIA检测TgAb、TPOAb、TSH。因此，对于透析患者，可在其血清中加入尿素酶后再进行检测，这样可以避免由于血清中尿素浓度的变化而使TgAb、TPOAb、TSH检测结果出现较大的改变。