胰腺癌患者手术前后外周血淋巴细胞亚群和血小板变化

程 娟，管世鹤，陈礼文，张敬军，陈淑英

（1.安徽医科大学第二附属医院检验科，安徽 合肥 230601；2.复旦大学附属华山医院康复医学科，上海 200040；3.复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 200040）

胰腺癌是消化道肿瘤中预后较差的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，缺乏特异的临床表现，当患者出现典型临床症状或影像学提示异常时，肿瘤已侵犯胰腺周围组织器官或发生远处转移。胰腺癌患者的5年生存率很低，手术是目前唯一可能治愈胰腺癌的方式[1]。免疫功能和炎症反应在癌症的发生、发展和转移中也发挥重要作用[2]。人体外周血淋巴细胞亚群和血小板（platelet，PLT）水平可反映体内炎症免疫反应状态。有研究结果显示，多种肿瘤患者存在淋巴细胞和PLT水平的异常，且与预后密切相关[3-4]，但与胰腺癌相关的研究较少。本研究旨在探讨胰腺癌患者术前、术后外周血淋巴细胞亚群和PLT水平的变化，及其与临床病理参数之间的相关性。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取复旦大学附属华山医院2019年1—5月接受手术治疗的66例胰腺癌患者，其中男35例、女31例，年龄（60.05±11.34）岁。选取同期体检健康者64名作为对照组，其中男34名、女30名，年龄（56.91±8.33）岁。所有胰腺癌患者均经术后病理检查确诊，符合胰腺癌诊断标准，胰腺癌的TNM分期采用第7版美国联合肿瘤委员会的病理分期标准[5]。病理结果包括肿瘤大小、组织分级及淋巴结转移等，临床资料完整。排除标准：（1）合并其他肿瘤；（2）术前经过化疗、放疗等抗肿瘤治疗；（3）有血液系统或自身免疫性疾病；（4）有感染性疾病或近期有急、慢性炎症疾病；（5）手术方式合并有脾脏切除术，或使用影响PLT的药物等。2个组之间年龄、性别等基本资料差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经复旦大学附属华山医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器和试剂

PLT计数采用XN-9000血液分析仪（日本Sysmex公司）及配套试剂测定。淋巴细胞亚群[CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞]采用FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）及配套试剂、校准微球检测。

1.3 检测方法

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集胰腺癌患者术前1周、术后第7天和体检健康者的清晨空腹外周静脉血1.5～2 mL，共采集2管，摇匀后立即送检。按照血常规操作规程在2 h内完成PLT检测，检测前所有质控均在控。淋巴细胞亚群（CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞和NK细胞）检测方法为：向2支流式试管中分别添加CD3+/CD4+/CD45+/CD8+和CD3+/CD16+CD56+/CD45+/CD19+单克隆抗体20 μL，然后每管添加50 μL抗凝全血，充分均匀，室温避光孵育15 min后，添加450 μL溶血剂（溶血剂已1∶9稀释），15 min后上机检测，检测前用校准微球进行校准，并保证所有质控均在控。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。正态分布数据用±s表示，组间比较采用t检验。淋巴细胞亚群与PLT的相关性采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组术前、术后及对照组外周血淋巴细胞亚群和PLT水平比较

与对照组比较，胰腺癌组术前外周血中淋巴细胞亚群CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞明显降低（P<0.001），CD3+CD8+T细胞和PLT水平明显升高（P<0.05、P<0.001），B细胞和NK细胞水平差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

胰腺癌组术后CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞较术前明显升高（P<0.01、P<0.001），PLT水平较术前明显降低（P<0.01），CD3+CD8+T细胞、B细胞和NK细胞水平差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

胰腺癌术后组外周血C D 3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、PLT水平与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 胰腺癌患者术前淋巴细胞亚群和PLT水平与肿瘤临床病理参数的关系

胰腺癌患者术前外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、PLT水平与年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度及有无神经浸润无关（P>0.05），外周血CD3+CD4+T细胞、PLT水平与TNM分期、有无淋巴结转移有关（P<0.05），CD3+CD8+T细胞、B细胞、NK细胞水平与TNM分期、有无淋巴结转移无关（P>0.05）。见表2。

表1 胰腺癌术前组和对照组外周血淋巴细胞亚群和PLT水平比较 ±s

表1 胰腺癌术前组和对照组外周血淋巴细胞亚群和PLT水平比较 ±s

注：与对照组比较，*P<0.05、**P<0.001；与术前比较，#P<0.05、##P<0.001

B细胞/% NK细胞/% PLT计数/（×109/L）对照组 64 71.83±5.42 44.77±5.45 19.88±4.88 15.06±4.05 21.17±4.53 168.47±35.62胰腺癌组术前 66 64.06±13.69** 35.76±10.93** 22.67±8.25* 14.32±7.91 20.82±12.36 204.64±62.30**术后 66 70.85±11.32## 47.38±9.23## 20.94±8.04 15.50±6.50 20.94±9.40 167.83±56.14#组别 例数 CD3+T细胞/%CD3+CD4+T细胞/%CD3+CD8+T细胞/%

表2 胰腺癌患者术前淋巴细胞亚群和PLT水平与临床病理参数的关系

2.3 胰腺癌患者术前外周血淋巴细胞亚群与PLT水平的相关性分析

Spearman相关分析结果显示，胰腺癌患者术前外周血CD3+CD4+T细胞水平与PLT水平呈负相关（r=-0.44，P<0.01），CD3+T细胞（r=-0.14）、CD3+CD8+T细胞（r=-0.04）、B细胞（r=-0.10）、NK细胞（r=0.11）水平与PLT水平均不相关（P>0.05）。

3 讨论

胰腺癌预后极差，术后5年生存率<5%[6]。目前手术是治疗胰腺癌的主要手段，肿瘤患者自身的免疫力也是评估患者预后的重要因素。有研究报道显示，肿瘤的发生、发展和转移与机体的免疫监视密切相关[7]，机体抗肿瘤的免疫监视功能中淋巴细胞介导的细胞免疫一直被认为是最主要的免疫方式[8]。细胞免疫的主要效应细胞是T细胞，CD3+T细胞反映机体总的细胞免疫状态，CD3+CD4+T细胞是辅助性T细胞，可辅助诱导其他免疫细胞共同发挥抗肿瘤作用，CD3+CD8+T细胞是抑制性T细胞，通过自身及抑制因子起负向免疫调控作用。B细胞主要反映机体的体液免疫功能，其数量降低与体液免疫缺陷相关。NK细胞主要介导机体的非特异性免疫。本研究结果显示，与对照组比较，胰腺癌组术前外周血中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞水平明显降低（P<0.001），CD3+CD8+T细胞明显升高（P<0.05），提示胰腺癌患者在荷瘤状态下机体处于免疫抑制状态，其机制可能是肿瘤细胞产生大量的免疫抑制因子，使CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞明显减少，同时低下的免疫功能为肿瘤生长、转移创造条件[9]。胰腺癌组术后CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞水平均明显高于术前（P<0.01、P<0.001），CD3+CD8+T细胞、B细胞和NK细胞水平差异均无统计学意义（P>0.05），胰腺癌组术后各指标与对照组比较差异也均无统计学意义（P>0.05），表明手术后胰腺癌患者的免疫功能有所恢复，且主要以细胞免疫恢复为主。本研究结果还显示，术前CD3+CD4+T细胞水平与胰腺癌的TNM分期和淋巴结转移有关，这表明CD3+CD4+T细胞可能参与胰腺癌转移、侵袭的免疫调节机制。

PLT不仅在止血、血栓形成和促进伤口愈合过程中发挥重要作用，同时与机体免疫和肿瘤发生、发展密切相关[10]。PLT能够从多途径促进肿瘤的转移，主要机制为PLT可与肿瘤细胞形成癌栓保护层，利于肿瘤细胞在循环运输过程中逃避免疫监视；PLT可帮助肿瘤细胞免受血流高剪切力的损伤，从而保护肿瘤细胞不被机体防御机制清除；PLT自身也可降低免疫监视作用，招募粒细胞促进早期转移微环境形成[11]。新生肿瘤也可通过分泌白细胞介素-6和组织因子等活性物质促进PLT的生成和活化，而活化的PLT可分泌如血管内皮生长因子、PLT衍生生长因子等进一步促进肿瘤新生血管的形成和肿瘤的发展[12]。有研究结果显示，多种肿瘤均出现PLT水平升高，且PLT水平升高与预后有关[13-14]。本研究结果显示，与对照组比较，胰腺癌组术前外周血PLT水平明显升高（P<0.01），且与胰腺癌不同组织分级和淋巴结转移明显相关（P<0.01），术后第7天患者外周血PLT水平基本恢复至正常水平，进一步表明PLT在胰腺癌的发生、发展及预后监测方面发挥重要作用。

淋巴细胞和PLT均是参与免疫炎症和血栓形成过程的重要细胞成分，PLT通过释放多种促有丝分裂活性介质对CD3+CD4+T淋巴细胞的增殖发挥调节作用[15]。PLT因子4通过减少白细胞介素-2的生成，对CD3+/CD28抗体诱导的CD3+CD4+T淋巴细胞的增殖产生抑制作用[16]。淋巴细胞和PLT之间可通过直接结合或在趋化因子、黏附分子等介导下影响彼此功能。本研究结果显示，胰腺癌患者术前外周血CD3+CD4+T细胞水平降低、PLT水平升高，提示CD3+CD4+T和PLT共同参与了胰腺癌的发生和发展，其机制可能与PLT通过促有丝分裂介质或其他分子抑制CD3+CD4+T淋巴细胞增殖有关。本研究结果还显示，胰腺癌患者术前CD3+CD4+T淋巴细胞与PLT水平呈负相关（r=-0.44，P<0.01），推断两者对胰腺癌的进程和预后可能存在协同效应。然而本研究纳入的病例数较少，后续还需加大样本量进行验证，另外还需对CD3+CD4+T细胞和PLT在胰腺癌发生、发展和转移中的分子机制进行深入研究。

综上所述，胰腺癌患者细胞免疫功能受到严重抑制，而经手术治疗后患者免疫功能可有所恢复。初步证实淋巴细胞免疫异常、PLT与胰腺癌患者疾病的发生、发展过程相关。