A、B、J 和K 亚群禽白血病病毒多重PCR 检测方法的建立及应用

俞 燕，周 生，李建梅，高明燕，程 旭，姜 逸，赵秀美，徐 步

（中国农业科学院 家禽研究所，江苏 扬州 225125）

禽白血病是垂直传播性疾病，控制该病最有效的措施是对鸡群进行种源净化。主要通过对种鸡核心群定期进行外源性禽白血病病毒（Avian leukosis vi⁃rus，ALV）检测，及时淘汰阳性鸡，建立无外源性ALV 感染的种鸡群。因此，高效、快速、便捷的检测方法有助于控制ALV 的传播。国内外对ALV 的检测和鉴定方法主要有病毒分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）及基于PCR 的分子生物学检测技术等[1-5]。病毒分离方法最可靠，但检测周期长，需要结合其它方法才能鉴定亚群。群特异性抗原ELISA 检测方法在我国临床上应用最广，操作相对简便，有商品化试剂盒可以使用，但不能区分内源性和外源性ALV。IFA 比较直观，但需要用到特异性单克隆抗体。针对ALV 的PCR 方法已有报道，但多为鉴定一种亚群的单一PCR 或荧光定量PCR[6-8]。多重PCR 可在同一体系中同时扩增多个目的基因，节省时间和成本，检测效率显著高于单一PCR。已有报道建立了针对ALV-A、ALV-B 和ALV-J 的多重PCR 方法[9-10]，但对于目前新鉴定且在黄羽肉鸡和地方品种鸡中广泛流行的ALV-K 并未涉及。鉴于此，本研究拟建立一种能同时检测主要流行亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 的多重PCR 方法，为禽白血病流行病学调查及外源性ALV初步鉴定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料ALV-A 分离株JS15AJH03、ALV-B 分离株JS15BJ01、ALV-J 分离株JS15YXB01和ALV-K 分离株JS17LK01 均为本实验室在开展禽白血病净化中分离所得，并经env 基因测序鉴定。对内源性ALV 有抵抗力的鸡成纤维细胞系DF-1，为本实验室传代并保存。

H9 亚型禽流感病毒（AIV）cDNA、新城疫病毒（NDV）cDNA、马立克氏病病毒（MDV）DNA、禽网状内皮组织增生症病毒（REV）cDNA、传染性支气管炎病毒（IBV）cDNA 及禽呼肠孤病毒（ARV）cDNA 均由本实验室保存。临床样品，包括表观健康鸡抗凝血样品及病死鸡肝、脾、肾等肿瘤组织样品，均来自于开展禽白血病净化的地方品种鸡。

Premix ExTaq DNA 聚合酶、pMD19-T 载体、JM109 大肠杆菌感受态细胞、 DNAiso Reagent、RNAiso Plus、反转录试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清购自Gibco 公司；ALV 抗原检测试剂盒购自IDEXX 公司。

1.2 引物设计与合成参考Gao[10]建立的检测ALV-A、ALV-B 和ALV-J 多重PCR 方法，根据Gen⁃Bank 登录及本实验室测序验证的ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 病毒株基因序列设计多重PCR 引物组：在pol 基因保守区域设计通用上游引物PF；在gp85 基因设计亚群特异性下游引物：ALV-A 下游引物AR、ALV-B 下游引物BR、ALV-J 下游引物JR 及ALV-K 下游引物KR（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病毒分离与检测采集无菌抗凝血样品，离心分离血浆备用；肝、脾、肾等肿瘤组织样品用含青链霉素的灭菌PBS 研磨后离心，取上清经0.2 μm滤膜过滤后取滤液；上述样品各取100 μL，接种DF-1 细胞，5%CO237 ℃孵育2 h 后，弃去培养基，用含1%胎牛血清的DMEM 培养基维持培养7 d后，-20 ℃反复冻融2 次，收集细胞上清利用ALV抗原检测试剂盒进行检测。

表1 引物序列及相关信息Table 1 Primer sequences and relative information

1.4 病毒RNA 提取及反转录无菌抗凝血样品离心后取血浆和白细胞层；病料组织样品研磨后，离心取上清，上述样品各取200 μL 利用RNAiso Plus 提取RNA，利用反转录试剂盒分别反转录为cDNA。

1.5 标准质粒样品的构建与鉴定将ALV 分离株JS15AJH03、JS15BJ01、JS15YXB01 和JS17LK01 感染后的DF-1 细胞分别利用DNAiso Reagent 提取各病毒株前病毒DNA 为模板，分别以PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 为引物，进行PCR 扩增。PCR 反应程序：95 ℃1 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃5 min；4 ℃保存。胶回收PCR 产物，分别连接pMD19-T 载体并转化JM109 感受态细胞，培养的菌液在氨苄抗性LB 固体平皿上划线接种，过夜培养。每个平皿各选3 个阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。经测序验证的阳性克隆用质粒提取试剂盒提取质粒，分别命名为pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K，采用Eppendorf 6131核酸蛋白检测仪测定浓度，并计算拷贝数。

1.6 多重PCR 方法的建立

1.6.1 多重PCR反应条件优化将构建的质粒标准品pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 等比例混合，稀释至混合物中各质粒浓度为2.5×106拷贝/μL，以此作为模板，以PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 为引物，采用方阵法进行多重PCR 反应条件的优化：包括各引物浓度（0.8 μmol/L、0.6 μmol/L、0.4 μmol/L、0.3 μmol/L、0.2 μmol/L、0.15 μmol/L、0.1 μmol/L、0.075 μmol/L、0.05 μmol/L、0.0375 μmol/L、0.025 μmol/L、0.05 μmol/L）、退火温度（50.0 ℃、50.7 ℃、51.8 ℃、53.6 ℃、55.7 ℃、57.8℃、59.9 ℃、61.9 ℃、64.1 ℃、65.8 ℃、67.1 ℃、68.0 ℃）、循环数（20、25、30、35、40）等，以确定多重PCR 的最佳反应条件。

1.6.2 多重PCR特异性试验分别将ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 分 离 株JS15AJH03、 JS15BJ01、JS15YXB01 和JS17LK01 前病毒DNA 稀释至10 ng/μL，以单独及混合物作为模板；同时以实验室保存的H9亚型AIV cDNA、NDV cDNA、MDV DNA、REV cD⁃NA、IBV cDNA 及ARV cDNA 作为模板，以优化的反应条件进行多重PCR 检测，验证该方法的特异性。

1.6.3 多重PCR 敏感性试验分别将构建的标准质 粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 单 独及混合后做10 倍倍比稀释至各质粒浓度为1×109～1×100拷贝/μL，以优化的反应条件进行单模板单重PCR 和混合模板多重PCR 检测，验证该方法的敏感性。

1.6.4 多重PCR 重复性试验采用优化的反应条件，对标准质粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 的三个浓度混合模板（1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL）进行多重PCR 检测，每个浓度模板设3 个重复，以验证该方法的批内重复性；并在不同时间对上述三个浓度质粒模板进行4 次重复检测，以验证该方法的批间重复性。

1.6.5 多重PCR 与病毒分离检测方法比较将采集的96 份表观健康鸡抗凝血样品及21 份肿瘤组织样品按1.3 方法进行病毒分离检测；同时以1.4 方法制备病毒cDNA，并用建立的多重PCR 方法进行检测，比较两种方法的检测结果；将阳性样本利用可扩增env 基因全长的ALV 通用引物Env-F：5'-CGA GAGTGGCTCGCGAGATGG-3'/Env-R：5'-ACTACATT TCCCCCTCCCTAT-3'进行PCR 扩增，并对扩增产物进行测序和亚群鉴定。

1.7 多重PCR 检测方法临床应用对2012 年～2017年收集的119 份经病毒分离、ALV 抗原ELISA 检测为阳性的样品，包括101 份血浆及18 份肝、脾、肾等肿瘤组织样品，按1.5 方法提取前病毒DNA，采用本实验建立的ALV 多重PCR 方法对上述样品进行检测，以了解我国地方品种鸡群禽白血病流行情况及感染类型。

2 结 果

2.1 标准质粒样品的构建分别以各ALV 分离株前病毒DNA 为模板，以PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 为引物，进行PCR 扩增。结果显示，分离株JS15AJH03、JS15BJ01、JS15YXB01 和JS17LK01 分别在567 bp、417 bp、195 bp 和742 bp 处出现各目的条带，均与预期大小相符（图1）。重组质粒测序结果显示，阳性克隆目的序列与亲本病毒株完全一致，表 明 重 组 质 粒pMD19A、 pMD19B、 pMD19J 和pMD19K 构建正确。经计算，各质粒标准品的浓度分别为4.2×1010拷贝/μL、4.9×1010拷贝/μL、5.0×1010拷贝/μL、4.7×1010拷贝/μL，将其分别稀释至1×1010拷贝/μL。

图1 各ALV 分离株PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification of ALV-A,ALV-B,ALV-J and ALV-K

2.2 多重PCR 检测方法的优化与建立以构建的质粒标准品pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K作为模板，PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 为引物，对多重PCR的反应条件进行优化。结果显示，PF为0.2 μmol/L，AR、BR、JR、KR为0.1 μmol/L，退火温度为56.0 ℃，30 个循环时，扩增效果最佳；对ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K 单一及各组合模式下的质粒模板均能扩增出目的条带（图2）。表明优化和建立的多重PCR 方法能有效检测ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K。

2.3 多重PCR 的特异性试验结果使用优化的多重PCR 反应条件，对各ALV 分离株前病毒DNA 模板，以及AIV、NDV、MDV、REV、IBV、ARV 的DNA 或cDNA 模板进行检测，结果显示，多重PCR 方法对ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K 单模板及混合模板均能扩增出目的条带；而对AIV、NDV、MDV、REV、IBV 及ARV 模板均未扩增出特异性条带（图3）。表明所建立的多重PCR方法特异性强。

图2 多重PCR 反应条件的优化Fig.2 Optimization of reaction conditions of multiple PCR

图3 多重PCR 特异性的检测结果Fig.3 Specificity of multiplex PCR

2.4 多重PCR 的敏感性试验结果分别使用常规PCR 和多重PCR 方法，对梯度稀释的pMD19A、pMD19B、pMD19J、pMD19K 标准质粒和混合质粒进行敏感性检测。结果显示，常规PCR 对pMD19K、pMD19A、pMD19B、pMD19J 标准质粒的检出下限均为1×103拷贝/μL；多重PCR 对其混合质粒的检出下限也为1×103拷贝/μL（图4）。表明所建立的多重PCR 方法具有较高的敏感性。

2.5 多重PCR 的重复性试验结果使用优化的多重PCR 反应条件，对pMD19A、pMD19B、pMD19J、pMD19K 3 个浓度混合质粒模板分别进行批内和批间重复试验。结果显示，每个浓度模板批内3 个重复检测（图5A）和批间4 次重复检测（图5B），均能扩增出与目的片段大小一致的条带，且同一浓度模板重复结果较为一致。表明所建立的多重PCR 方法具有良好的重复性。

图4 多重PCR 敏感性的检测结果Fig.4 Sensitivity of multiplex PCR

图5 多重PCR 重复性的检测结果Fig.5 Repeatability of multiplex PCR

2.6 两种检测方法的比较结果对采集的117 份临床样品同时进行病毒分离和多重PCR 检测。结果显示，多重PCR 共检出39 份阳性样品，阳性率33.3%；病毒分离检测出38 份阳性样品，阳性率32.5%，二者符合率99.1%。其中，对血浆样品的检测，两种方法符合率100%；但对组织样品的检测，有1 份病毒分离为阴性的样品，多重PCR 检测为ALV-K 感染（表2）。阳性样品的测序结果与多重PCR 检测结果完全相符。表明所建立的多重PCR 方法具有较高的临床检测能力。

2.7 多重PCR 检测方法的临床应用结果使用本研究建立的多重PCR 方法对病毒分离检测为阳性的101 份血浆样品和18 份肿瘤组织样品前病毒DNA 进行检测。结果显示，所有样品，单一感染ALV-J 检出率最高，达43.7%；新发现的ALV-K 检出率为17.6%，显 著 高 于 经 典 的ALV-A 和ALV-B 检 出 率1.7%、4.2%；存在ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染，检出率分别为2.5%、21.0%；以及ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K 的三重感染，检出率分别为1.7%、5.0%、2.5%（表3）。结果表明，ALV在地方品种鸡感染具有多样性与复杂性，ALV-J 仍为主要流行亚群。

病毒株来源上，分离自病料组织的绝大部分病毒株为ALV-J，占44.4%；ALV-J+K 二重感染居其次，为27.8%；ALV-K 的单重感染率为16.7%；同时存在ALV-A 的单重感染和ALV-A+B+J 的三重感染，各占5.6%（表3）。其它病毒株均来源于表观健康鸡血浆样品，具有与病料组织同样的感染趋势，但感染类型更为复杂多样。结果表明，对地方品种鸡致病性最强的仍为ALV-J，但同时不能忽视ALV-K 的影响。

不同鸡种间，ALV-J 检出率最高，达95.8%（23/24）；ALV-K 其 次，为70.8%（17/24）；ALV-A 和ALV-B 检出率均为25.0%（6/24）。结果表明，ALV-J和ALV-K 在地方品种鸡中感染具有普遍性。

表2 多重PCR 与病毒分离检测比较结果Table 2 Comparison of multiplex PCR and virus isolation

表3 多重PCR 对血浆和组织样品检测结果Table 3 Detection of plasma and tissue samples by multiplex PCR

3 讨 论

禽白血病是由ALV 引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，对鸡具有致病性的主要为外源性ALV。通过笔者前期及其他学者流行病学调查发现，我国鸡群中流行的外源性ALV 主要为ALV-J、ALV-A、ALV-B，以及地方品种鸡群中的ALV-K[11-13]。国内外已经建立了多种ALV 检测方法，包括病原学、血清学及分子生物学检测技术，每种方法均有其优缺点和适用性。本研究针对目前我国鸡群中流行的主要外源性ALV，首次建立了检测ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 的多重PCR 方法，能够有效鉴别ALV 单一或多重感染，比常规PCR 更为简便、快捷，极大地提高了检测效率。

目的基因的选择与引物设计是PCR 方法成败的关键。为尽量减少多重PCR 引物间的相互干扰，本研究参考Gao[10]引物设计方法，根据不同亚群ALV基因组特征，在ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K的pol 基因保守区域设计一条通用上游引物，在gp85 基因分别设计4 条亚群特异性下游引物，能扩增出567 bp、417 bp、195 bp 和742 bp 电泳时可有效区分的目的条带。使用该引物组建立的多重PCR，对构建的标准质粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 检测效果良好，能扩增出ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 单一、二重、三重、四重混合模板的目的条带，而与AIV、NDV、MDV、REV、IBV、ARV 等禽类常见病毒无特异性反应，进一步证实了引物设计的有效性。敏感性试验结果表明，本研究建立的多重PCR 对pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 标准质粒样品的检测，四重混合模板检测下限为1×103拷贝/μL，与单重PCR 敏感性相当，且与其它研究报道的ALV PCR 方法敏感性在同一水平[9-10]。重复性试验结果亦表明，所建立的多重PCR方法具有良好的批内和批间重复性。

ALV 病毒分离检测只能检出具有一定量活病毒的样品，对样品的采集、运输和保存要求较高，且检测过程需要7 d～9 d，费时费力。多重PCR 能直接从病料DNA 或cDNA 样品检出ALV，大大提高了检测效率[9-10]。本研究结果亦表明，所建立的多重PCR方法对临床样品的检测，与病毒分离法相比，检出率更高，这可能与组织样品经冻融后病毒失活有关，也可能与ALV-K 的低复制效率相关。使用分子生物学检测技术对ALV 亚群进行鉴定，通常使用env 基因通用引物扩增并测序，将gp85 基因与参考株进行比对分析，以鉴定亚群[14-15]。将本研究多重PCR 检测结果与分离株env 基因测序亚群鉴定结果进行比较，发现单重感染env 基因测序结果与多重PCR 结果完全一致；但多重感染，env 基因测序需要筛选更多的阳性克隆进行测序，才能鉴定出所有亚群。因此，在测序数量有限的情况下，多重PCR 比env 基因测序对亚群鉴定更具优势。本研究建立的多重PCR 目的亚群为ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K，并不能检出其它亚群ALV，这也是该方法的局限，后续可在反应体系中增加针对其它亚群的特异性引物以扩大检测范围。

从建立的多重PCR 对24 个鸡种的阳性样品检测结果看，地方品种鸡禽白血病感染类型复杂、多样，ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K 单重感染占阳性样本的67.2%，并存在ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染，及ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K 的三重感染。尽管过去也有禽白血病多重感染的报道[10,16]，但如此多感染类型同时存在地方品种鸡还是首次发现。不同亚群ALV 在同一鸡体内共感染，很可能造成病毒间的基因重组，使毒株致病性增强甚至产生新亚群[17]，进而威胁到种质资源安全，这一潜在风险应引起重视。从检出率来看，不管是表观健康鸡血浆样品还是病料组织样品，ALV-J 检出率最高，其次为ALV-J+K 二重感染，再次为ALV-K。因此，对地方品种鸡致病性最强、危害最为严重的仍为ALV-J，这与陈静[12]、李阳[13]等调查结果一致，但也不能忽视ALV-K 的影响。本研究中，24 个鸡种有23 个检测到了ALV-J，17 个检测到了ALV-K，显著高于ALV-A 和ALV-B 检出率。ALV-K 已成为除ALV-J 外，对地方品种鸡威胁最大的一个亚群。ALV-K 致病性如何、其存在是否会协同ALV-J 致病有待研究。同时，还应加快实施对我国地方品种鸡的外源性ALV 净化，以保护我国丰富的种质资源。