张鸿艳,任静,杨晴,门剑龙(天津医科大学总医院精准医学中心,天津300052)
D-二聚体是反映凝血活化和继发性纤溶亢进的标志物,其血浆浓度与血管内纤维蛋白负荷密切相关,在临床上已成为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)排除诊断和风险评估的重要指标[1-2]。目前,国内实验室主要用高敏微粒凝集定量法和酶联免疫荧光法检测D-二聚体,应用效果良好。近年来,又出现了2种D-二聚体检测系统,分别是采用纤维蛋白原等量单位(fibrinogen equivalent units,FEU)的化学发光法和采用D-二聚体单位(D-dimer units,DDU)的胶乳免疫比浊法。根据文献[3-4],这2种方法的健康人参考值和排除诊断临界值有别于既往的D-二聚体检测方法,尤其缺乏中国人群的基线数据,且由于在临床上的应用时间较短,实验室对其在辅助临床诊断方面的敏感性和特异性也了解不足。因此,本研究通过2个亚组研究,分析2 431例不同年龄的健康人、200例VTE患者以及200例非VTE疾病患者的血浆D-二聚体数据,初步获得2种新型D-二聚体检测方法的健康人参考值、排除VTE临界值及其诊断性能。
1.1研究对象
1.1.1健康人第1组 收集2015年1月—2016年1月天津医科大学总医院的体检健康者1 207例,男601例,女606例,年龄20~69岁。排除标准:酗酒史、3个月内献血、高血压、肝肾疾病、全身炎性疾病、血液系统疾病、内分泌系统疾病、哺乳期、妊娠、肥胖、吸烟、3个月内的用药史和手术史。标本用于建立化学发光法参考值。
1.1.2健康人第2组 收集2016年1月—12月天津医科大学总医院的体检健康者1 224例,男609例,女615例,年龄20~68岁,排除标准同1.1.1。标本用于建立免疫比浊法参考值。
1.1.3VTE患者组 选择2015年3月—2016年12月天津医科大学总医院收治的初诊患者200例,男100例,女100例,年龄(55.2±9.4)岁,其中致死性肺栓塞(pulmonary embolism,PE)患者27例,非致死性PE患者22例,下肢深静脉血栓(deep venous thrombosis,DVT)合并PE患者16例,DVT患者135例;诊断经血管造影、超声、计算机断层扫描或肺通气/灌注扫描证实,符合《肺血栓栓塞症诊治与预防指南》和《中国血栓性疾病防治指南》关于急性静脉血栓栓塞症的诊断标准[1-2]。
1.1.4非VTE疾病对照组 选择2015年3月—2016年12月天津医科大学总医院收治的患者200例,男99例,女101例,年龄(55.6±9.2)岁,其中急性冠脉综合征患者71例,普通外科术后患者66例,创伤患者61例,诊断均经临床、实验室及影像学检查证实。入组患者除外活动性恶性肿瘤和妊娠期患者。非VTE疾病对照组与VTE患者组的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过天津医科大学总医院伦理委员会审批(ZYY-JY-2017-01)。
1.2方法 静脉血标本以枸椽酸钠抗凝(109 mmol/L,3.2%)按1∶9进行抗凝,2 664×g离心10 min,取上层乏血小板血浆进行测定,于采集后4 h内测定血浆D-二聚体。(1)化学发光法:在美国Instrumentation Laboratoy公司ACL AcuStar化学发光仪上用其配套HemosIL®AcuStar D-dimer试剂盒测定,按说明书进行操作;(2)胶乳免疫比浊法:在日本积水公司CP 2000型全自动血液凝固仪上用其配套试剂盒测定,按说明书进行操作。
1.3统计学分析 用SPSS 17.0统计软件进行。偏态分布数据以中位数(四分位数)[M(P25,P75)]表示,多组间数据比对采用Kruskal-WallisH检验,两组间数据比较采用Mann-WhitneyU检验,以P<0.05为差异有统计学意义。采用ROC曲线评价D-二聚体的诊断性能。
2.1健康人第1组化学发光法D-二聚体测定结果
2.1.1各年龄段不同性别间结果比较 在20~30岁组、31~40岁组、41~50岁组、51~60岁组中,女性的血浆D-二聚体水平均高于男性,差异均有统计学意义(P值分别为<0.001、<0.001、<0.001和0.012);在≥61岁组中,男、女健康人间差异无统计学意义(P=0.114)。见表1。
表1 健康人第1组化学发光法D-二聚体检测结果(ng/mL FEU,M[P25,P75])
2.1.2健康人第1组不同年龄段间结果比较 健康人第1组血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高,各年龄段间差异有统计学意义(χ2=159.088,P<0.001)。其中20~30岁组与31~40岁组比较、31~40岁组与41~50岁组比较,差异无统计学意义(U值分别为28 721和26 321,P均>0.05);41~50岁组与51~60岁比较、51~60岁组与≥61岁组比较,差异有统计学意义(U值分别为22 070和2 262,P均<0.001)。
2.1.3男性健康人群不同年龄段间结果比较 男性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高,各年龄段间差异有统计学意义(χ2=134.853,P<0.001)。男性20~30岁组与31~40岁组比较,差异无统计学意义(U=7 126,P=0.890);31~40岁组与41~50岁组比较、41~50岁组与51~60岁组比较、51~60岁组与≥61岁组比较,差异有统计学意义(U值分别为5 839、4 704和5 602,P均<0.05)。
2.1.4女性健康人群不同年龄段间结果比较 女性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高,各年龄段间差异有统计学意义(χ2=44.330,P<0.001)。女性20~30岁组与31~40岁组比较、31~40岁组与41~50岁组比较,差异无统计学意义(U值分别为7 129、7 200,P均>0.05);41~50岁组与51~60岁组比较、51~60岁组与≥61岁组比较,差异有统计学意义(U值分别为6 335和5 675,P均<0.05)。
2.2健康人第2组免疫比浊法D-二聚体测定结果
2.2.1各年龄段不同性别间结果比较 在20~30岁组、31~40岁组、41~50岁组、51~60岁组中,女性的血浆D-二聚体水平均高于男性,差异均有统计学意义(P<0.001);在≥61岁组中,男、女健康人间差异无统计学意义(P=0.125),见表2。
表2 健康人第2组免疫比浊法D-二聚体检测结果(ng/mL DDU,M[P25,P75])
2.2.2总人群不同年龄段间结果比较 健康人血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高,各年龄段间差异有统计学意义(χ2=89.634,P<0.001)。其中20~30岁组与31~40岁组比较、41~50岁组与51~60岁比较,差异无统计学意义(U值分别为30 307和27 526,P均>0.05 );31~40岁组与41~50岁组比较、51~60岁组与≥61岁组比较,差异有统计学意义(U值分别为23 300和22 953,P均<0.05)。
2.2.3男性健康人群不同年龄段间结果比较 男性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高,各年龄段间差异有统计学意义(χ2=126.779,P<0.001)。男性20~30岁组与31~40岁组比较、41~50岁组与51~60岁组比较,差异无统计学意义(U值分别为7 102、6 270,P均>0.05);31~40岁组与41~50岁组比较、51~60岁组与≥61岁组比较,差异有统计学意义(U值分别为5 466和3 812,P均<0.05)。
2.2.4女性健康人群不同年龄段间结果比较 女性健康人总体血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高,各年龄段间差异有统计学意义(χ2=14.207,P<0.007)。女性20~30岁组与31~40岁组比较、41~50岁组与51~60岁组比较、51~60岁组与≥61岁组比较,各组间差异均无统计学意义(U值分别为8 030、7 424和6 728,P均>0.05);31~40岁组与41~50岁组比较,差异有统计学意义(U=5 821,P=0.005)。
2.32种D-二聚体检测方法的参考值 根据2.1~2.2数据,初步获得2种D-二聚体检测方法的参考值(计算95%百分位数上侧限值)。化学发光法(ACL AcuStar化学发光仪)总体人群为<528 ng/mL,其中≤50岁男性为<271 ng/mL,>50岁男性为<637 ng/mL;≤50岁女性为<441 ng/mL,>50岁女性为<673 ng/mL。免疫比浊法(CP 2000型全自动血液凝固仪)总体人群为<780 ng/mL,其中≤50岁男性为<650 ng/mL,>50岁男性为<802 ng/mL;≤50岁女性为<810 ng/mL,>50岁女性为<830 ng/mL。
2.4D-二聚体排除诊断VTE的临界值和诊断性能 200例非VTE疾病对照组和200例VTE患者组以化学发光法测定的D-二聚体结果分别为2 344(205,10 123) ng/mL FEU和2 525(509,13 734)ng/mL FEU,以免疫比浊法测定的D-二聚体结果分别为2 490(327,14 249)ng/mL DDU和3 156(636,17 168)ng/mL DDU。将VTE组、非VTE疾病对照组患者的D-二聚体检测结果与健康人数据置于同一数据集内,用ROC曲线分析2种方法对VTE的排除诊断性能,见表3。
表3 2种D-二聚体检测方法排除诊断VTE的ROC曲线分析结果
D-二聚体是排除诊断静脉血栓和监测血栓风险的重要指标,广泛应用于临床各个学科。作为一种纤维蛋白降解产物,D-二聚体片段有很强的异质性,使得不同试验方法检出的D-二聚体类型差异较大,至今尚未实现标准化,其测定结果有ng/mL、μg/mL和mg/L等多种报告方式,且结果定义也不一致(包括FEU和DDU 2种形式),因此源自不同方法学的数据不能进行相互换算和横向比对[5]。
基于既往资料,D-二聚体数据属于偏态分布,根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)关于参考值设定的C28-A2文件,偏态分布数据在制定参考值时,样本数量应多于正态分布数据(≥100例),采用百分位数法,以增高为异常。本研究中的各个年龄段均纳入>198个观察个体,其中各年龄段内的性别亚组均纳入>100例观察个体,可以满足计算95%百分位数上侧界值的要求。
既往研究发现,老年人的血浆D-二聚体水平高于青壮年人群[4-6],本研究再次验证了这一现象。结果显示,化学发光法和免疫比浊法的D-二聚体检测结果均表现出随年龄逐渐增高的特点,且各年龄段的多组间比较显示差异有统计学意义(P<0.001),其中20~30岁组D-二聚体水平与31~40岁组差异无统计学意义,表明20~40岁健康人群的止凝血功能状态相对稳定,上述特征在2个检测系统、不同性别人群中表现一致。
在20~30岁组、31~40岁组、41~50岁组、51~60岁组中,女性的血浆D-二聚体水平都高于男性且差异有统计学意义。化学发光法检测总体人群参考值为<528 ng/mL,在≤50岁人群和>50岁人群中,女性参考值(< 441 ng/mL和<673 ng/mL)均高于男性(<271 ng/mL和<637 ng/mL);免疫比浊法的参考值特征也表现出相同的趋势,总体人群参考值为<780 ng/mL,女性参考值(810 ng/mL和830 ng/mL)高于男性(650 ng/mL和802 ng/mL),其原因可能与雌激素水平相关[7-9]。
此外,在≥61岁组,男、女性别间的差异无统计学意义,则进一步提示随年龄增长,导致凝血活化的因素逐渐增多,D-二聚体水平随之增高,在高龄人群中,血浆D-二聚体浓度可能受到基于血管因素和血液流动力学的多方面影响,从而掩盖了性别间的水平差异。需注意,虽然2种实验方法的测定结果均显示出现血浆D-二聚体浓度随年龄增高的现象,但二者在各年龄段的趋势特征有所不同,例如化学发光法的D-二聚体水平在51~60岁与≥61岁的女性人群比较中差异有统计学意义,但在免疫比浊法的数据中则无统计学意义。本研究认为其原因可能与2种方法所检出的不同D-二聚体片段在血浆中浓度存在差异有关,同时也不能排除是来自不同亚组人群样本所造成的误差,因此尚需更多临床观察进行验证。
既往研究表明,血浆D-二聚体浓度随年龄增加会降低其排除诊断VTE的特异性,因此对于50岁以上的低度VTE临床可能性患者,宜采用“年龄×10 ng/mL”的方式上调临界值以提高诊断性能(在维持高敏感性的基础上,提高特异性)[6-11],2014年《欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology,ESC)急性肺栓塞诊断和用药指南》[12]、2018年《中国血栓性疾病防治指南》[1]、《肺血栓栓塞症诊治与预防指南》[2]、2019年《ESC急性肺栓塞诊断和用药指南》[13]均推荐该模式用于VTE的排除诊断。ROC分析显示,2种D-二聚体检测方法在各年龄段人群中,VTE排除诊断的临界值均随年龄增加而提高,且都有很好的敏感性和阴性预测值(但诊断敏感性在高龄人群中有所降低),并保持相对稳定的特异性和阳性预测值,这一特征与既往其他方法学研究一致[6-11],实验室应结合自身技术平台、患者群以及疾病分布特征制定适合本医疗机构的临界值[1-2,14-16]。此外,由于不同方法检测的D-二聚体在年龄变化趋势上存在一定性别差异,提示临床在评估数据的临床意义时,应事先了解本机构实验室的方法学类型。
综上所述,虽然化学发光法与免疫比浊法在检测原理、结果定义等方面有显著差异,但二者在健康人群中的总体数据分布特征相近,对VTE排除诊断均具有高度敏感性和良好的阴性预测值,表明这2种方法可安全用于VTE的排除诊断。