迷走神经刺激对脑缺血再灌注大鼠磷酸腺苷活化蛋白激酶-沉默信息调节因子2相关酶1自噬通路的影响

魏海萍，郭佳，王欢，葛朝明

兰州大学第二医院神经内科，甘肃兰州市 730030

脑卒中严重危害中老年人健康，但缺乏有效干预措施[1]。缺血半影区神经元自噬是缺血性脑卒中发生、发展的重要病理生理机制[2]。脑缺血发生时存在自噬[3]，自噬可减轻缺血性脑卒中神经损伤[4]，在脑缺血中发挥脑保护作用[5]，也可加重脑缺血损伤[6]。迷走神经刺激(vagus nerve stimulation,VNS)已被广泛应用于治疗各种疾病[7]，如改善抑郁小鼠症状[8]、癫痫、头痛和阿尔茨海默病等[9-11]，姜黄素联合VNS 可减轻脑缺血再灌注损伤引起的行为障碍[12]。

调控腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)信号通路的自噬可改善认知障碍[13]。硒代蛋氨酸通过AMPK 激活下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，从而激活皮层神经元自噬，改善阿尔茨海默病小鼠认知功能[14]。AMPK 激活需要α 亚基苏氨酸(Threonine)172 位点磷酸化，通过活化AMPK/mTOR/Unc-51 样自噬活化激酶信号通路可激活自噬[15]。

沉默信息调节因子2 相关酶1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)是一种重要的去乙酰化酶，在神经退行性疾病中保护神经元[16]。Sirt1 能与微管相关蛋白1 轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)相互作用，在自噬泡形成阶段起重要作用。Sirt1 的活化可正向调节AMPK，AMPK-Sirt1通路与认知障碍有关[17]。

本研究探讨VNS在缺血性脑卒中大鼠缺血半影区细胞自噬中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及造模

成年雄性SPF 级Sprague-Dawley 大鼠56 只，由兰州大学实验动物中心提供，分为正常组(n=14)、假手术组(n=14)、模型组(n=14)和VNS 组(n=14)。后两组参照文献[18-19]线栓法阻断大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MCAO) 1 h 再 灌 注。VNS 组 在 血流阻断0.5 h 时，行左侧VNS(因左侧迷走神经发出支配心脏纤维少)，实验参数和操作参照文献[20]。再灌注24 h后，行以下测试。

所有操作遵循动物福利与伦理原则。

1.2 Longa评分和TTC染色

各组取5 只，采用Longa 评分法[18]行神经缺损程度评估。

各组取4 只断头取脑，切5 片，TTC(美国SIGMA公司)染色，Image-pro plus软件计算梗死体积。

1.3 Western blotting

各组取5 只大鼠脑缺血半影区脑组织，制备蛋白样品，并进行凝胶电泳(上海江美生物科技有限公司)、转膜，牛奶封闭，加抗Beclin-1、β-actin (PROTEINTECH 公司)、LC3、AMPK、P-AMPK(Thr172)、Sirt1(CST 公司)一抗体孵育，发光显影曝光目的蛋白。stern blotting其他试剂由SIGMA公司提供。计算各条带与正常组的光密度百分比。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件行数据分析。结果以()表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LDS检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 脑梗死体积

模型组和VNS 组明显出现白色梗死区(图1)，与模型组相比，VNS组梗死区体积显著减少(P＜0.001)。见表1。

2.2 Longa评分

与假手术组相比，模型组和VNS 组Longa 评分明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，VNS 组大鼠Longa评分下降(P＜0.05)。见表2。

2.3 Western blotting

与假手术组相比，模型组和VNS 组Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I比、P-AMPK(Thr172)和Sirt1 蛋白表达显著下降(P＜0.001)。与模型组相比，VNS 组Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I比、P-AMPK(Thr172)和Sirt1 蛋白表达显著升高(P＜0.001)。见图2、表3。

图1 各组脑梗死体积(TTT染色)

表1 各组脑梗死体积(%)

表2 各组大鼠Longa评分比较

图2 各组脑缺血半影区自噬相关蛋白表达(Western blotting)

表3 各组脑缺血半影区自噬相关蛋白表达(%)

3 讨论

减轻脑缺血后神经元损伤可改善缺血性脑卒中的预后[19]。本研究显示，VNS 能减少大鼠脑梗死体积，减轻神经功能缺损，与以前报道VNS能减轻脑缺血损伤相符[20]。本研究还显示，脑缺血后，半影区自噬水平下降，而VNS 能使自噬水平回升，可能与AMPK磷酸化水平和Sirt1蛋白水平回升有关。

在缺血性脑卒中复杂的缺血再灌注损伤过程中，自噬是一个连续更新的生理过程。自噬有双刃剑作用[21]。自噬调控大多数在自噬诱导阶段，其中AMPK通过调控mTOR 对自噬进行调节和反馈[22]。AktmTOR 通路属于经典通路，激活Akt-mTOR 通路调节自噬水平，可实现脑保护作用[23]。Sirt1 是AMPK 下游靶蛋白[24]。VNS 通过激活AMPK-Sirt1 通路活化自噬，减少神经病理演变进程，改善由于急速血流阻断引起的神经细胞坏死，发挥脑保护作用。然而，过度自噬将加重脑损伤[25]。VNS 通过激活自噬减轻脑缺血损伤的机制有待进一步研究。

综上所述，VNS 可能通过调节AMPK-Sirt1 自噬通路，减轻大鼠缺血性脑损伤。但自噬是把双刃剑，何种水平自噬有利于神经保护、VNS的具体参数与自噬水平的相关性、VNS 的介入时机等，尚需进一步研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。