黑菇多糖的提取工艺优化及理化性质和抗氧化活性研究

李艺萌，李文芝，钟瑞芳，刘瑞海，陈 健*

1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510641

2.广州时代食品与生命健康有限公司，广东 广州 510670

黑菇(R.adusta(Pers. ) Fr.)属于红菇类，红菇科，又名烟色红菇、火炭菌，主要生长在福建、广西、四川、江西的部分地区。黑菇夏秋季单生、群生或丛生于阔叶林、针叶林中地上，生长期间菌肉初为白色，采摘后变淡烟色、棕灰色至深棕灰色，最后呈黑色。黑菇菌肉较厚且味道鲜美，民间也常用来治疗痢疾等肠胃问题，是一种食药两用菌。目前我国可食用的60多种红菇科菌菇大多富含多糖、三萜、氨基酸、维生素和多种矿质元素[1-2]，同时具有低脂肪、低热量、无胆固醇的特点，有较高的营养、食用价值和一定的保健作用，可作为功能性食品。

活性多糖是指具有某种特殊生理活性的多糖化合物，是一类广泛存在于植物、动物和微生物中的天然活性物质，大部分活性多糖具有一定的抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力能力[3-5]。近年来，已有大量的研究表明多数红菇类菌物多糖具有较强的生物活性，可作为一种天然抗氧化剂来代替人工合成抗氧化剂，并通过清除体内过量自由基以达到抗氧化的目的。然而目前仅有少数研究表明黑菇多糖对小鼠肉瘤180及艾氏癌具有一定的抑制作用[6-8]，但对于黑菇多糖的提取工艺、理化性质以及抗氧化活性研究较少。故作者通过响应面分析得出热水浸提法提取黑菇多糖的最佳条件，在此条件下使用D354FD树脂和Sevage试剂法对黑菇多糖进行脱色和脱蛋白，通过DEAE离子层析柱进一步纯化。初步探索了黑菇多糖的理化性质和抗氧化活性，为其提取和进一步探究结构以及生物活性评价提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑菇干品：福建绿蕾农特产贸易有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝、葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡聚糖标品(4.4、9.9、21.4、43.5、124、196、401 kDa)：美国 Sigma公司；D354FD树脂：广州广联津化化工有限公司；DEAE浓硫酸、苯酚、氢氧化钠、正丁醇、氯仿、邻苯三酚、水杨酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5000可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；KDC-4低速离心机：科大创新股份有限公司； DE-310真空冷冻干燥机：德国威思公司；Agilent 6890 N气相色谱仪：美国安捷伦公司；Vector33傅立叶红外光谱仪、核磁共振波谱仪：Bruck公司；1525型高效液相色谱仪：美国 Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 黑菇粗多糖的提取与优化

准确称取过40目筛的黑菇子实体粉末2 g于250 mL锥形瓶中，对液料比(15、20、25、30、35 mL/g)、提取温度(70、75、80、85、90 ℃)、提取时间(90、120、150、180、210 min)分别进行单因素试验。过滤后取上清液，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以多糖得率来确定各因素的最优值[9]。在单因素试验的基础上根据Box-Benhnken中心组合设计原理，设计三因素三水平的响应面试验。

1.3.2 黑菇多糖的制备

干燥的黑菇子实体→粉碎过筛→最佳工艺条件下热水浸提→离心(4 000 r/min，10 min)→取上清液→D354FD树脂脱色→醇沉→离心(4 000 r/min，10 min)→烘干→蒸馏水复溶→Sevage法脱蛋白→醇沉、离心→蒸馏水复溶→DEAE柱层析→浓缩、透析→冷冻干燥→黑菇多糖(RAP)。

1.3.3 黑菇多糖理化性质的测定

总糖含量的测定：分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖溶液(0.1 mg/mL)于试管中，补水至2 mL，用苯酚-硫酸法测定吸光度。标准曲线方程：Y=5.438 5X-0.001 8，R2=0.994 4。取2 mL 0.1 mg/mL多糖溶液按同样的方法测定其总糖含量。

蛋白质含量的测定：分别吸取0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 0.1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液，补水至1 mL，考马斯亮蓝法测定吸光度。标准曲线方程：Y=0.339 5X-0.106 8，R2=0.994 0。取1 mL 0.1 mg/mL多糖溶液按同样的方法测定其蛋白含量。

糖醛酸含量的测定：分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.7、1.0 mL 0.1 mg/mL的半乳糖醛酸溶液，补水至1 mL，硫酸-咔唑法测定吸光度。标准曲线方程：Y=6.857 1X+0.077 6，R2=0.999 4。取1 mL 0.1 mg/mL 多糖溶液按同样的方法测其糖醛酸含量。

淀粉的测定：称取黑菇多糖配制成1 mg/mL的多糖溶液，向溶液中滴入先前已经配制好的碘-碘化钾溶液并观察其颜色，若溶液变蓝说明有淀粉的存在，反之则无淀粉。

1.3.4 黑菇多糖的结构分析

1.3.4.1 光谱分析

紫外光谱分析：将RAP配制成1 mg/mL的溶液，以蒸馏水为对照组，在190～500 nm处进行紫外扫描，以横纵坐标分别为波长、吸光度绘图。

红外光谱分析：称取2 mg干燥的RAP，与砂浆中的溴化钾粉末均匀研磨并压成薄膜，使用傅立叶变换红外光谱仪在4 000～500 cm-1扫描，记录扫描曲线。

1.3.4.2 单糖组成分析

称取RAP 10 mg于安培管中，使用4 mL 2 mol/L 的三氟乙酸酸解(110 ℃)8 h。旋干并加入少量甲醇再次蒸干，重复3次。加入10 mg盐酸羟胺和1 mL的吡啶，溶解后沸水浴30 min。取出冷却后加入1 mL的醋酸酐，摇匀并继续沸水浴30 min，冷却后过0.45 μm滤膜待检测。称取单糖标品各10 mg于试管中，按照上述方法处理制作混标。

气相色谱分析条件：Agilent 6890 N气相色谱仪，FID检测器；色谱柱，DB-1701毛细管柱；高纯氮气，流速1 mL/min；初始温度180 ℃，2 ℃/min升温220 ℃(维持1 min)，5 ℃/min加热至250 ℃(维持2 min)；进样口温度250 ℃；蒸发室温250 ℃；探测器温300 ℃；流速1.0 mL/min；分流比 10∶1。

1.3.4.3 分子质量的测定

称取5 mg RAP，用流动相溶解，过0.45 μm滤膜后进样，使用凝胶渗透色谱法测定样品，通过峰型判断多糖均一性并根据标准曲线计算样品的分子质量。

检测条件：Waters 2414示差检测器，凝胶柱HPLC 1000 PWXL柱(7.8 mm×300 mm)和HPLC 500 PWXL柱(7.8 mm×300 mm)串联，流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液，流速0.8 mL/min，标准质量浓度2 mg/mL，进样体积20 μL，柱温35 ℃，检测时间35 min。标准品：葡聚糖标准品(4.4、9.9、21.4、43.5、124、196、277、401 kDa)。

1.3.4.4 核磁共振测定

称取60 mg的RAP在烧杯中，加入1 mL D2O溶解，在4 ℃下静置24 h后冻干，反复3次。在核磁管中加入0.8 mL D2O溶解的样品，测定多糖的氢、碳谱。

1.3.5 黑菇多糖的抗氧化研究

1.3.5.1 ·OH清除能力测定[10]

在96孔板中加入50 μL不同浓度的RAP溶液、50 μL 9 mmol/L的FeSO4和50 μL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇，振荡10 min后加入50 μL 8.8 mmol/L的H2O2，Vc为阳性对照，去离子水为空白对照，37 ℃反应30 min，摇匀后于510 nm处测吸光度，重复3次。

式中：A0为不含样品溶液吸光度；A1为不含水杨酸-乙醇溶液吸光度；A2为样品溶液吸光度。

1.3.5.2 O2-·清除能力测定[10]

96孔板中加入50 mmol/L Tris-HCl缓冲液130 μL，25 ℃水浴20 min后加入29 μL不同浓度的RAP溶液，加入11.6 μL 25 mmol/L邻苯三酚，25 ℃水浴5 min 后加入29 μL 8 mmol/L HCl终止反应，Vc为阳性对照，去离子水为空白对照，299 nm处测定其吸光度，重复3次。

式中：A0为空白对照吸光度；A1为样品溶液吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

单因素试验结果见图1，当提取时间180 min、提取温度80 ℃、液料比25∶1(mL/g)时，多糖得率分别有最优值。

图1 单因素试验结果

2.2 响应面试验

响应面优化黑菇多糖得率的试验结果如表1所示。

表1 响应面试验

表2 模型方差分析

响应面因素的交互作用见图2。结合图和软件预测结果得出各因素对多糖得率的影响强度依次为液料比>提取时间>提取温度。预测得出最适工艺条件：温度80.04 ℃，料液比1∶25.96，提取时间184.37 min，多糖得率为9.84%。对优化参数进行修正，即料液比1∶26，温度80 ℃，提取时间185 min，黑菇多糖的实际得率为9.42%。

图2 响应面因素的交互作用

2.3 黑菇多糖的理化性质

黑菇多糖为黑色絮状物，不发生碘-碘化钾反应，属于非淀粉多糖。通过葡萄糖标准曲线测得总糖含量为80.03%，通过考马斯亮蓝G-250标准曲线测得蛋白质含量为0.17%，通过糖醛酸标准曲线测得糖醛酸含量为13.20%。

2.4 黑菇多糖的结构特征分析

2.4.1 黑菇多糖的光谱特征分析

RAP的紫外光谱图见图 3(A)，RAP在260、280 nm处无明显吸收峰，与宋佩林等[11]研究的瘤背石磺多糖紫外谱线趋势相同，表明该多糖基本不含核酸及蛋白质。

注：A为紫外光谱图；B为红外光谱图。

2.4.2 黑菇多糖分子量的测定分析

RAP的GPC峰型为一个较对称的单一峰(图4)，保留时间25.9 min，通过标准曲线计算得其重均分子质量Mw为5 763 Da，初步认为是一种小分子多糖。葡聚糖标准曲线方程为logMw=874-258V+30.7V2-1.83V3+0.054 1V4-0.000 639V5。

图4 黑菇多糖的GPC图谱

2.4.3 黑菇多糖的单糖组成分析

RAP的气相色谱图如图5所示，与图5(A)(标准品)对比可得，RAP中鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的含量比值为1∶5.53∶8.83∶10.62∶16.00，其中半乳糖的含量最高。

注：A为单糖混合标品；B为黑菇多糖。1-鼠李糖、2-岩藻糖、3-阿拉伯糖、4-木糖、5-甘露糖、6-葡萄糖、7-半乳糖。

2.4.4 黑菇多糖的核磁共振分析

图6(A)是RAP的核磁共振1H谱图，其在4.5～5.5 ppm内有5个信号峰，表明RAP主要由5种糖残基组成[13]。5.0 ppm左右的信号峰表明RAP中有α和β两种糖苷构型存在；1.9～2.2 ppm范围内信号峰是糖残基的乙酰基取代基[14]。图6(B)为RAP的核磁共振13C谱图，其中信号峰主要集中在60～80 ppm和95～105 ppm。60～80 ppm范围内的信号峰值RAP中的部分取代反应发生在C2、C3和C4位置，表明RAP中可能存在1,2→糖苷键和1,4→糖苷键[13]。98～108 ppm的信号峰表明RAP主要含有5种糖残基且主要为α构型[15-18]。69.50 ppm和60.69 ppm的化学位移表明RAP中部分C-6键被取代[19]。

注：A为H谱；B为C谱。

2.5 黑菇多糖的抗氧化研究

·OH是一种有较强的氧化能力的活性氧，会造成机体红细胞、氨基酸及DNA氧化性损伤，是细胞突变或坏死的病因之一[10]。如图7(A)所示，以Vc作阳性对照，RAP对·OH的清除率和质量浓度呈正相关，当RAP质量浓度为8 mg/mL时清除率最大(78.32%)；当Vc质量浓度为0.4 mg/mL时，对·OH的清除率达到最大(89.19%)。和Vc相比，RAP在高质量浓度时对·OH有一定的清除能力。O2-·是其他活性氧的前体，能通过一系列的生理生化反应生成其他氧自由基，导致细胞非正常凋亡、体内酶活性的降低、不饱和脂肪酸的过氧化以及部分核酸和细胞膜的降解[20]。如图7(B)所示，RAP对O2-·的清除能力和质量浓度呈正相关，当质量浓度为8 mg/mL时清除率最大(34.71%)，当Vc质量浓度达到0.4 mg/mL时，对O2-·的清除率达到最大(78.36%)。RAP对·OH的清除能力优于O2-·，但和阳性对照相比仍然差异较明显。表明黑菇多糖虽然有一定的抗氧化活性，但在此领域的功能还有待深入研究。

注：A为RAP对·OH的清除能力；B为RAP对O2-·的清除能力。

3 结论

在单因素试验的基础上应用响应面分析法优化了黑菇多糖的提取条件，得出各因素对黑菇多糖得率的影响大小顺序为液料比>提取时间>提取温度。以黑菇多糖的得率为评价指标，预测黑菇多糖的最优提取条件为温度80.04 ℃、料液比1∶25.96、时间184.37 min，多糖得率为9.84%，考虑到实际操作，将优化参数进行修正，即料液比1∶26，温度80 ℃，提取时间185 min，黑菇粗多糖的实际得率为9.42%。

采用最佳工艺条件制备黑菇多糖，通过D354FD树脂脱色、Sevage法除蛋白和DEAE层析柱纯化后得到RAP，其重均分子质量Mw为5 763 Da，总糖含量为80.03%，蛋白质含量为0.17%，糖醛酸含量为13.20%，不含可溶性淀粉。紫外扫描光谱表明RAP基本不含核酸及蛋白质。红外光谱分析表明，RAP在3 402、2 149、1 653 cm-1处的吸收峰是多糖特征吸收峰，其主要构型为吡喃型糖环。气相色谱分析表明RAP中主要含有的5种单糖比值为鼠李糖∶岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶5.53∶8.83∶10.62∶16.00。NMR的分析图谱表明RAP主要是由5种糖残基构成的杂多糖，同时存在α和β两种糖苷构型，且α构型多于β构型。

抗氧化试验表明:RAP在0.25～8 mg/mL的范围内对·OH和O2-·均具有一定的清除能力，并且与其质量浓度呈正相关。当RAP浓度8 mg/mL时，对·OH清除率为78.32%，对O2-·清除率达到34.71%，表明黑菇多糖具有一定的体外抗氧化活性。该研究结果可为黑菇多糖的进一步研究与应用奠定基础。