毛木耳5.584产漆酶发酵条件优化及降解麦麸的研究

徐安民，李 力，马 森，王晓曦

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

白腐菌是目前所知最有效、最主要的木质素降解微生物，是唯一能在纯系培养中将木质素降解成 CO2和 H2O 的微生物，通过分泌包括漆酶在内的木质素降解酶系来降解生物质中的木质纤维素成分[1-3]。漆酶在木质素分解过程中起着重要作用，以O2为电子受体催化多酚化合物，经4次单电子传递形成酮及自由基的含铜蛋白酶[4]，广泛的底物特异性使其在生物燃料、绿色有机物合成、食品工业、生物传感器、生物检测等领域都有应用[5]。目前对漆酶的研究主要集中在高产白腐菌菌株的筛选和发酵优化及漆酶对木质素的生物降解等方面。

毛木耳是一类重要的白腐菌，分布在山林及庭园中的各种阔叶树的腐木上。毛木耳是可食用菌，素有“树上海蚕皮”之称，质地脆滑，清新爽口[6]，能够产生包括漆酶在内的多种木质素降解酶系。麦麸即小麦的种皮，是小麦加工过程中的副产物，占小麦总质量的20%左右。麦麸中富含膳食纤维、淀粉、矿物质和维生素等，其中功能性成分膳食纤维占35%～50%[7]。研究表明，膳食纤维具有降血糖、降血脂、改善肠道菌群的功效。有关麦麸的利用以及全麦食品的开发已成为研究热点，但麦麸中的不溶性膳食纤维易造成产品口感粗糙，可食用性较差[8]。小麦麸皮中不溶性膳食纤维主要包括纤维素、半纤维素和木质素，木质素作为一种填充和黏结物质，在植物细胞壁中以物理或化学的方式使纤维素之间黏结和加固，增加植物的机械强度[9]，它通过化学键与半纤维素连接，包裹在纤维素之外,形成木质纤维素，限制了酶对细胞壁的穿透[10]。目前改变麦麸特性的方法主要有理化方法、酶解法和发酵法，理化方法和酶解法成本高，发酵法主要是用乳酸菌、酵母菌进行发酵，但它们不能专一有效地降解木质素。

作者前期筛选获得了1株优良的毛木耳菌株Auriculariapolytricha5.584(以下简称AP5.584)，发现其产漆酶能力较强且产生的漆酶具有较高的稳定性[11]。为深入了解该菌株发酵产漆酶的水平以及对麸皮的降解作用，以漆酶活性为响应值，采用响应面分析法建立模型，优化AP5.584产漆酶的条件，提高漆酶活性，从而为小麦麸皮木质纤维素生物降解的综合应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

AP5.584为河南工业大学粮油食品学院小麦麸皮加工实验室前期优筛菌株，购于中国科学院微生物研究所。

1.1.2 小麦麸皮

小麦麸皮：中鹤现代农业开发集团有限公司。小麦麸皮的前处理参照陶颜娟[12]的方法。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH自然，1×105Pa灭菌30 min。

种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏2 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁1.5 g/L，维生素B10.5 g/L，pH自然，1×105Pa灭菌30 min。

基础发酵培养基：麸皮30 g/L，磷酸二氢钾 3 g/L，硫酸镁1.5 g/L，硫酸铵1.4 g/L，氯化钙 0.3 g/L，硫酸铁5 mg/L，硫酸锰 1.6 mg/L，维生素B10.02 g/L，pH自然，分装至250 mL的三角瓶中，1×105Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 发酵粗酶液的制备

将活化后的菌株由PDA培养基接到种子培养基，于26 ℃、160 r/min 摇床培养6 d，得到种子培养液。吸取摇匀的种子培养液10 mL加入装有100 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，每1株菌株接种3瓶，在26 ℃、160 r/min的恒温摇床上振荡培养9 d。发酵液用4层纱布过滤，滤液在4 ℃、4 500 r/min的条件下离心15 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 单因素试验

麸皮质量浓度对AP5.584产漆酶活性的影响：以小麦麸皮为碳源，质量浓度分别为5、10、20、30、40、50、60 g/L，分析麸皮质量浓度对菌株产漆酶活性的影响。

金属离子对AP5.584产漆酶活性的影响：所选金属离子为Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe2+,质量浓度均为0.5 g/L，分析不同金属离子对菌株产漆酶活性的影响。

金属离子质量浓度对AP5.584产漆酶活性的影响：Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe2+的质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L，分析金属离子质量浓度对菌株产漆酶活性的影响。

培养基pH值对AP5.584产漆酶活性的影响：分别用 1%盐酸或1%氢氧化钠将产酶培养液pH值调至3、4、5、6、7、8、9，分析培养基pH值对产漆酶活性的影响。

摇瓶转速对AP5.584产漆酶活性的影响：摇床转速分别设置为90、120、150、180、210 r/min，分析摇床转速对AP5.584产漆酶活性的影响。

上述单因素试验除了分别设置的不同培养条件外，均为 250 mL 三角瓶中加入 100 mL 最佳产酶培养基，接种10%种子培养液，26 ℃、160 r/min摇床避光培养9 d。

1.2.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以麸皮质量浓度、Cu2+质量浓度、培养基pH值、摇瓶转速为自变量，AP5.584产漆酶的活性为响应值，利用Box-Behnken中心组合原理设计四因素三水平响应面试验，并采用Design expert 8.0.6软件进行数据分析。

1.2.4 菌株AP5.584对麦麸的降解

按照10%接种量将种子液接入发酵培养基中，摇床培养15 d，同时另一组接入最佳发酵培养基中以最佳转速摇床培养15 d，每个样品做3个平行，然后将生物预处理后的小麦麸皮过滤洗净，60 ℃烘至恒质量，粉碎混匀，备用。

1.2.5 测定方法

漆酶活性的测定参照Glenn等[13]的方法。麦麸中木质素含量的测定参照王玉万等[14]的方法。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 麸皮质量浓度对AP5.584产漆酶活性的影响

从图1可以看出，AP5.584菌株在不同质量浓度麸皮的培养基中，漆酶的表达有显著差异，麸皮质量浓度为10 g/L时，发酵液中漆酶活性最低，液体培养基中的营养物质稀少，不足以供菌株生长合成细胞自身所需要的物质，影响菌株的生长和后期次级代谢产物的生成。随着麸皮质量浓度的增加，营养物质增多，菌株细胞内的各种化学反应加快，菌球逐渐增加，发酵液中漆酶活性升高，当麸皮质量浓度为40 g/L时，漆酶活性最高，且与最低活性差异显著。但是当麸皮质量浓度进一步增加时，发酵液中漆酶活性开始下降，液体培养基中高质量浓度的麸皮不利于营养物质和氧气的传递，菌株生长减缓，进而抑制了漆酶的分泌。初步确定较适的麸皮质量浓度为40 g/L。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2—图4同。

2.1.2 金属离子对AP5.584产漆酶活性的影响

大多数酶的组成都含有金属离子，且都为酶蛋白分子的活性中心，使细胞结构保持稳定，调节细胞的渗透压。向培养基中分别加入不同种类的金属离子，考察它们对菌株发酵产酶活性的影响，结果如图2所示。从图2可以看出，不同金属离子对菌株产漆酶活性的影响有显著差异，Fe2+、Co2+对菌株产漆酶活性有抑制作用，其次是Zn2+、Mn2+，Cu2+能够显著促进漆酶活性的提高，这是因为漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，Cu2+在漆酶的催化过程中起电子传递的作用，这与吴雪君等[15]的研究结果一致。

图2 金属离子对AP5.584产漆酶活性的影响

2.1.3 Cu2+质量浓度对AP5.584产漆酶活性的影响

培养基中Cu2+质量浓度会影响菌株的生长从而影响产物的合成。从图3可以看出，当Cu2+质量浓度为1.0 g/L时，漆酶活性达到最大，随着Cu2+质量浓度的增大，漆酶活性随之降低，当培养基中Cu2+质量浓度提高到3.0 g/L时，漆酶活性只有43.24 U/mL，由此可见，低质量浓度的Cu2+对菌株的生长没有抑制作用，但低质量浓度的Cu2+不足以充分触发漆酶的合成机制，因此漆酶活性不高；而高质量浓度的Cu2+会抑制漆酶的表达，这是因为高质量浓度的Cu2+对微生物细胞具有极高的毒性[16]。初步确定较适的Cu2+质量浓度为1.0 g/L。

图3 Cu2+质量浓度对AP5.584产漆酶活性的影响

2.1.4 培养基初始pH值对AP5.584产漆酶活性的影响

pH值对微生物的影响在于氢离子会与细胞质膜上的酶相互作用，细胞内的pH值会影响胞内酶的活性、微生物的代谢活动以及各种酶的活力[17]。由图4可知，当培养基初始pH值为5时，漆酶活性达到最高，为172.69 U/mL，可以看出菌株比较适合在偏酸性的环境中生长。当培养基初始pH值为4～6时，微生物细胞内的化学和酶促反应都以较快的速度进行，菌株生长加快，促进漆酶的表达。当pH值过高或过低时，菌株的生长代谢活动受到抑制。初步确定较适的培养基初始pH值为5。

图4 培养基初始pH值对AP5.584产漆酶活性的影响

2.1.5 摇瓶转速对AP5.584产漆酶活性的影响

摇瓶转速会直接影响培养基的溶氧量，搅拌可降低细胞壁表面的液膜阻力，改善细胞对氧和营养物质的吸收，同时降低细胞周围“废物”和“废气”的浓度，有利于微生物的代谢[18]。AP5.584为好氧菌，转速过低时，培养基溶氧量也低，菌株生长代谢速度变慢，从而影响漆酶的积累。由图5可知，在一定范围内，提高摇床转速可以增加培养基的溶氧量，菌株生长代谢加快，从而促进菌株对漆酶的表达。但是摇瓶转速过高时，强大的剪切力会打断菌丝，造成细胞损伤，不利于菌体生长，引起自溶减产，漆酶的产量也相应减少。初步确定较适的摇瓶转速为180 r/min。

图5 摇瓶转速对AP5.584产漆酶活性的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果与分析

对表1进行回归分析和显著性检验，建立了麸皮质量浓度、Cu2+质量浓度、培养基初始pH值、摇瓶转速4个自变量和漆酶活性响应指标关系的二阶多项式方程：Y=188.47+5.92A+13.01B+4.00C+1.39D-2.77AB+0.055AC-3.92AD+3.98BC+3.21BD-2.28CD-13.91A2-11.31B2-17.28C2-21.61D2。采用方差分析评价模型的充分性和适合度，以P值评价模型的显著性，结果见表2。

表1 响应面设计与结果

表2 回归模型方差分析

各因素交互作用对漆酶活性影响的响应面图见图6，图6(a)、图6(c)、图6(d)、图6(e)的曲面较陡，说明麸皮质量浓度和Cu2+质量浓度、麸皮质量浓度和摇瓶转速、Cu2+质量浓度和初始pH值、Cu2+质量浓度和摇瓶转速的交互作用对漆酶活性影响较显著。图6(b)、图6(f)的曲面较平缓，说明麸皮质量浓度和初始pH值、初始pH值和摇瓶转速的交互作用对漆酶活性影响较弱。图6(c)和图6(d)的等高线趋向椭圆形，说明麸皮质量浓度与摇瓶转速、Cu2+质量浓度和初始pH值交互作用明显。

图6 各因素交互作用对漆酶活性影响的响应曲面

2.2.2 最佳工艺条件及验证试验

通过软件分析得到菌株产漆酶活性的最优发酵条件:麸皮质量浓度41.46 g/L、Cu2+质量浓度1.30 g/L、 培养基初始pH 5.18、摇瓶转速181.62 r/min，漆酶活性预测值为193.18 U/mL。考虑到实际情况，将发酵条件调整为麸皮质量浓度41.50 g/L、Cu2+质量浓度1.30 g/L、培养基初始pH 5.18、摇瓶转速182 r/min，进行3次验证试验，得到漆酶活性平均值为188.54 U/mL，与模型预测值的误差为2.46%，理论值与预测值的偏差较小。

2.3 AP5.584对麦麸的降解

为了验证菌株对小麦麸皮的降解效果，对优化前后经菌株预处理后麸皮的木质素降解率进行分析比较。优化前的木质素降解率为36.24%，而优化后的木质素降解率可达68.72%，为优化前的1.9倍。

3 结论

麸皮质量浓度、Cu2+质量浓度、培养基初始pH值、摇瓶转速会导致AP5.584生产漆酶的能力有所改变，采用响应面试验对AP5,584的液态发酵条件进行了优化：麸皮质量浓度为41.50 g/L、Cu2+质量浓度为1.30 g/L、培养基初始pH 为5.18、摇瓶转速为182 r/min，优化后的AP5.584代谢速度加快，产酶旺盛，漆酶活性达到188.54 U/mL。漆酶活性的提高使得菌株对麦麸的降解效果进一步加强，优化后的木质素降解率为优化前的1.9倍，表明AP5.584在麸皮综合应用方面具有良好的应用前景。