模糊综合评判结合响应面法优化苹果酒发酵工艺

冯 涛，马博文，庄海宁，孙 敏，徐志民，杨末尧

（1.上海应用技术大学 香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.上海市农业科学院 食用菌研究所/家食用菌工程技术研究中心，上海 201403；3.美国路易斯安那州立大学 营养与食品科学学院，路易斯安那 巴吞鲁日70803）

我国是世界苹果生产第一大国，苹果酒是延长产业链，增加农副产品附加值的重要途径[1]。苹果酒是继葡萄酒之后的第二大果酒，是用新鲜苹果或浓缩苹果汁为原料酿造的一种酒精饮料[2]。苹果酒含有少量的乙醇，保留了苹果原有的糖类、氨基酸和矿物质等，饮用苹果酒可以调节人体新陈代谢、促进血液循环，软化血管、预防心血管硬化等疾病的发生[3]。苹果酒质量评判是企业进行产品评优、质量控制、产品分级、优化工艺的重要方法和手段，如何系统、综合地评判苹果酒质量，是苹果酒产业发展中亟待解决的问题[4]。但目前国内外对于苹果酒的质量评估还没有具体参考的标准，往往评定一款苹果酒好与不好主要是通过感官评分、酒精度以及某种特征香气物质质量浓度等单一指标作为评价优化的参考值，利用传统的感官品评，想要克服人的主观随意性也是客观了解真实品质的一个阻碍[5]，这些均不能全面客观地反映酒的真实品质。

模糊综合评判是对多种属性的单个事物，或者说其总体优劣受多种因素影响的事物，作出一个能合理的综合这些属性或因素的总体评判[6]。应用“隶属函数”来描述苹果酒风味差异的中间过渡，为准确的描述和客观评价苹果酒的品质提供了数学方法[7]。该研究采用模糊综合评价结合响应面设计试验对苹果酒发酵工艺进行优化[8-10]，随之对发酵成品的香气成分进行检测分析，较为全面的描述了苹果酒的品质特性，以期获得更加客观、贴近实际要求的优化工艺参数和工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母菌株（葡萄酒·果酒专用酵母）：是选自山东省烟台帝伯仕酵母有限公司；苹果（品种为红富士）：市售。

果胶酶（CE 3.2.1.89，＞90 000 mSU/g）、发酵助剂、焦亚硫酸钾、皂土：烟台帝伯仕商贸有限公司；壳聚糖（食品级）：江苏百味科技有限公司；纤维素酶（EC 3.2.1.15，＞22 500 U/g）：上海梯希爱化成工业发展有限公司；L-半胱氨酸（食品级）：广州豪翔精细化工有限公司；抗坏血酸（食品级）：郑州裕和食品添加剂有限公司。其他试剂均为分析纯，购于上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

VK-8002加热破壁机：德州市欧诺华生活电器有限公司；EMS-20S磁力搅拌水浴锅：常州市人和仪器厂；16-7383高压灭菌锅：上海宜川上岭仪表有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司；WYT-4型手持糖度计：泉州中友光学仪器有限公司；LAL2T酒精浓度计：广州市速为电子科技有限公司；6890-5973型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

苹果→清洗、切块→护色→榨汁→酶解分离→调糖、酸→灭菌→接种酵母→前发酵→倒罐→抽滤→后发酵→陈酿→过滤→终止发酵→苹果酒

操作要点：将红富士苹果用水清净晾干，去除果核，将苹果切成3～5 cm的苹果块。配制复合护色液（抗坏血酸添加量为0.20%、L-半胱氨酸添加量为0.07%，焦亚硫酸钾的添加量为0.1g/L），将苹果块浸泡于护色液中15 min，捞出晾干，于破碎机中榨汁[11]。分别添加60 mg/L的纤维素酶和果胶酶到苹果果浆中，恒温水浴55 ℃酶解1 h，静置澄清。四层纱布过滤后，用低温冷冻离心机5 000 r/min离心5 min，将分离得到的苹果清汁巴氏杀菌，冷却后加入蔗糖，调整总糖含量为18～20°Bx。在此基础上添加柠檬酸调整总酸含量。

苹果汁放入22 ℃的生化培养箱发酵7 d，第2天时加入已活化的帝伯仕发酵助剂（0.06～0.09 g/L）。发酵前期定时倒罐，搅拌5～15 min，发酵中期密闭发酵罐，发酵后期，当苹果酒的酒精度在3%vol左右，降温至0 ℃，终止发酵。添加0.06～0.1g/L的帝伯仕皂土和壳聚糖到苹果酒中下胶澄清，静置澄清3～5 d后，过滤分离。4 ℃冷藏3 d后，过滤，灌装，即得成品。

1.3.2 理化指标测定

酒精度：按照GB/T 15038—2005《葡萄酒果酒通用分析方法》，采用酒精计法测定；总糖：使用手持测糖仪；总酸：采用电位滴定法测定[12]。

1.3.3 苹果酒品质的模糊综合评判

感官评定采用百分制法，由20名经过培训的具有一定感官评定经验的评定员，按国标和参考前人结果[3，5]修正后苹果酒感官评分标准（见表1）的要求，对各个酒样从色泽（满分20分）、香气（满分40分）、滋味（满分30分）、风格（满分10分）4个方面进行感官评定，以很好、较好、一般、较差和差为评语集，建立单因素矩阵，构建主因素突出型综合评判模型，采用M评判模型进行分析[13-16]。

表1 苹果酒感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of cider

1.3.4 响应面试验设计

本试验在预试验结果和参考文献[3-6，17-19]的基础上，选取影响苹果酒品质的三个关键因子：初始pH值（A）、接种量（B）、初始糖度（C）作为试验考察对象，以苹果酒的模糊综合评判总分（Y）为因变量即响应值，采用Box-Behnken试验设计，因素水平见表2。

表2 苹果酒发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface tests

1.3.5 香气成分分析测定方法

香气富集方法：顶空固相微萃取法，取15 mL的顶空瓶，用无菌移液管加入10 mL待分析的苹果酒样和2.0 g NaCl，再加入0.3 mL 2-辛醇（质量浓度为4.00 mg/L）作内标，50 ℃平衡20 min，然后将经色谱进样口解吸30 min后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（美国Supelci.Co.）置入顶空瓶的上部顶空中，50 ℃吸附30 min。

香气测定仪器参数：色谱柱为DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm）柱；进样口温度200 ℃；柱温：初始温度50 ℃，保持0 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持2.5 min，以8 ℃/min升至220 ℃后，保留5 min。质谱条件：采用电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，接口温度为250 ℃，载气为N2，流量为1.8 mL/min，进样方式为分流进样，分流比为50∶1，保持3 min。

定性方法：气相色谱-质谱联用仪得出分析总离子流图，采用美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NIST）08质谱库和Wiley谱库用计算机进行检索与匹配，并结合参考资料，确认香气成分物质名称。依照正构烷烃（C7～C30）在相同时间下的保留时间，按照KOVATS保留指数公式计算挥发性物质的保留指数（retention index，RI），得到的RI值与Wiley7n.1数据库进行匹配，定性得到有效挥发性物质。

2 结果与分析

2.1 模糊数学模型的建立

2.1.1 建立评判集

依据表1对苹果酒品质的要求进行模糊综合评判，构建主因素突出型综合评价模型。

对象集U=｛u1，…，ui，…，un｝=｛1#，2#，…，16#，17#｝

因素集X=｛x1，…，xj，…，xn｝=｛色泽，香气，滋味，风格｝

评语集Y=｛y1，…，yp，…，ym｝=｛很好，较好，一般，较差，差｝

权重集W=｛w1，…，wi，…，wn｝=（0.20 0.30 0.40 0.10），其中

2.1.2 建立单因素评价矩阵

评判小组对每一因素进行逐个评判，对每个因素的每个评语的人次进行归一化处理，即A=[a1*，…，ai*，…，a5*]，其中

分别统计每一因素xi对应的模糊评价Rij=（ri1，ri2，…，rin）∈f（Y），可以得到每个苹果酒样品的因素模糊综合评价矩阵，得到酒样的感官评定结果见表3。

表3 不同苹果酒的感官评定结果Table 3 Sensory evaluation results of different ciders

2.1.3 线性转换

以1#酒样为例，可建立色泽、香气、滋味和风格等4个单因素的模糊评价矩阵：

由上述结果得到1#酒样的评判关系矩阵：

经过模糊线性转换[20-21]，得到模糊综合评判矩阵：

B=W×R=（b1，…，bj，…，b5）其中，模糊算子为M（·，⊕），即bj=

经计算得：B1=（0.395 0.35 0.205 0.03 0.02）

2.1.4 模糊综合评判总分

设定感官特殊性[17]：很好为100分，较好为80分，一般为60分，较差为40分，差为0分，可建立感官特殊性数集V=（100 80 60 40 0），则样品的模糊综合评判总分为：T=B×V。得到1#苹果酒样品的总分为：

T1=（0.395 0.35 0.205 0.03 0.02）×（100 80 60 40 0）=81

同理可得到2#～17#酒样的模糊综合评判总分，见表4。

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests

2.2 响应面优化试验结果

通过Design Expert 7.0软件对试验进行回归分析，预测苹果酒发酵的最优工艺参数，方差分析结果见表5。对表4中的试验数据进行多元回归拟合后，得到的各因素与苹果酒感官评分（Y）影响的二次多项回归模型：

从回归模型方差中可以看出，模型的一次项B以及二次项B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项A、C和二次项A2对结果影响显著（P＜0.05）；表明试验设计中选取的影响因素对结果影响显著，试验因素变化与因变量结果之间的影响关系真实可靠。交互项均P＞0.05，说明因素之间无交互影响，对苹果酒发酵的影响并不显著，应用该模型时可以不用考虑各因素之间的交互作用。

表5 响应面试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface methodology

由方差分析（表5）可以看出，模型的Fmodel=17.73＞F0.01（9，5）=10.16，P=0.000 5＜0.01，表明酵母接种量、初始糖度和初始pH值对苹果酒感官评分的影响显著；失拟项P=0.3649＞0.05，不显著，说明方程不失拟，可以用该模型分析和预测苹果酒发酵的最佳条件；苹果酒发酵模型决定系数R2=0.958 0，说明模型拟合程度良好，试验误差小，说明该模型是合适的；模型的调整决定系数R2Adj=0.903 9，说明该模型能解释约90.39%响应值的变化，拟合程度较好。

离散系数（coefficient of variation，CV）反映了单位均值上的离散程度，表示实验的精确度，本试验CV=2.19%，说明实验操作准确可信，可以用回归方程模型对苹果酒发酵工艺进行预测和分析。

试验采用响应面法优化苹果酒发酵条件，利用Design Expert 8.05b软件，由二元回归模型绘制响应面分析图，响应值对各因素A、B、C的分析见图1，直观的反映各因素对响应值的影响。

通过软件分析可以确定最佳发酵工艺参数：酵母菌接种量为9.69%，初始pH值为3.46，初始糖度为19.25 g/100 mL，感官评分预测值为89.266分。为实际操作所需，修正发酵工艺参数为酵母菌接种量10%，初始pH值3.5，初始糖度19 g/100 mL，经测定，此发酵条件下的苹果酒酒精度为3.7%vol，总糖含量（以葡萄糖计）为16.42 g/100 mL，总酸含量（以酒石酸计）为7.9 g/L，感官评分为90分。

图1 初始pH值、酵母接种量和初始糖度交互作用对苹果酒感官评分的响应面和等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,inoculum and initial sugar content on sensory quality of cider

2.3 苹果酒香气成分测定

为全面验证最佳酿造工艺下的苹果酒品质的优劣，本试验采用顶空固相微萃取/气质联用法及气味活度值（odor activity value，OAV）法测定苹果酒的风味物质成分和关键香气成分，结果见表6。

表6 苹果酒主要香气成分的定量分析结果Table 6 Quantitative analysis results of the main aroma components in cider

续表

由表6可知，苹果酒中共鉴定出33种香气成分，主要包括16种酯类（占所有香气物质种类总数的48.48%），9种醇类（27.27%）、4种酸类（12.12%），4种醛酮类（12.12%），与文献结果[22-24]相似。各类物质的质量浓度从高到低分别是醇类物质564.983 mg/L，酯类物质42.285 mg/L，酸类物质8.983 mg/L，醛酮类物质2.359 mg/L。

用OAV法从苹果酒香气中鉴定出10种关键香气组分：乙酸乙酯（4.93）、己酸乙酯（3.64）、辛酸乙酯（18.60）、戊酸乙酯（25.75）、癸酸乙酯（1.88）、肉豆蔻酸乙酯（14.00）、丁醇（137.96）、异戊醇（8.45）、苯乙醇（1.41）、辛酸（3.24）。这些物质的OAV均大于1，对苹果酒的整体风味有贡献。

3 结论

通过模糊综合评判结合响应面法对苹果酒发酵工艺条件进行优化，构建苹果酒感官品评的主因素突出型综合评判模型，得到最优发酵条件为：酵母菌接种量10%，初始pH值3.5，初始糖度19 g/100 mL，此发酵条件下的苹果酒酒精度为3.7%vol，总糖含量（以葡萄糖计）为16.42 g/100 mL，总酸含量（以酒石酸计）为7.9 g/L，感官评分为90分，与感官预测值相差不大，提高了传统感官评价的准确度、科学性和客观性。利用顶空固相微萃取/气质联用法和OAV法测定苹果酒的风味物质成分和关键香气组分，鉴定了苹果酒的10种风味突出贡献成分为辛酸乙酯、戊酸乙酯、丁醇等物质，为苹果酒香气的控制提供了理论支持。