拮抗大肠杆菌的海洋微生物的筛选与鉴定

王晓彤 ，金黎明*，俞 勇，宫小明，权春善，赵 晶，侯熙彦

（1.大连民族大学 生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116605；2.中国极地研究中心，上海 200136；3.潍坊出入境检验检疫局，山东 潍坊 261041）

大肠杆菌（Escherichia coli）是革兰氏阴性菌，一般不致病，但其中一些血清型比较特殊的大肠杆菌对人与动物具有致病性，这些大肠杆菌通常会携带一些毒力因子，通过释放毒素或袭击肠黏膜细胞等方式致病[1]。食物是大肠杆菌致病菌株的传播方式之一，大肠杆菌常存在于蛋类、肉制品、乳类及其制品中。当今社会，抗生素的滥用已经威胁到人类安全，各种新型耐药菌株的感染现象明显增多，耐药大肠杆菌的扩散程度日益严峻，这些都严重威胁着人类食品安全[2-4]。

海洋微生物因其具有为了长期适应复杂的海洋环境而生存的耐高盐、寡营养、耐高压等特性，可能产生结构新颖的次生代谢产物，已成为分离纯化研究的热点[5-9]。郑虹等[10]从福清市江阴镇近海海域筛选出1株海洋芽孢杆菌HY4，对枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、大肠杆菌等都具有较强的拮抗作用。

芽孢杆菌能够产生的抗菌物质有细菌素、表面活性素、芬枯草菌素、抗菌肽等，这些抗菌物质一般具有广谱的抑菌活性、性质比较稳定，使得芽孢杆菌成为当今研究生防菌株的热点之一[11-12]，高兆建等[13]研究发现，枯草芽孢杆菌L-13产生的抗菌肽在新鲜果蔬、肉制品的保藏过程中能起到短期防腐的效果。目前，芽孢杆菌作为一种绿色、高效的微生物菌种已被广泛应用于食品、农业等多个领域[14]。

本研究从北冰洋沉积物样品中筛选能够有效抑制大肠杆菌的海洋微生物，通过对其菌株形态进行观察、分析其生理生化试验结果以及在分子生物学角度进行分析，进行分类鉴定，并进行了拮抗8种病原微生物的抑菌谱研究。该研究为进一步分离纯化其具有的抗菌活性物质，从中寻找具有较高生物活性且结构新颖的抗菌药物奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

样品：2014年北极科学考察队采集的北冰洋沉积物样品。

1.1.2 指示菌

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）：本学院实验室保藏。

1.1.3 主要试剂

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂：生工生物股份有限公司；氯化钠（分析纯）、胰化蛋白胨（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责行公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 培养基

溶菌肉汤（lysogeny broth，LB）培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，琼脂15 g，氯化钠10 g，去离子水1 L，pH 7.0。培养海洋微生物的培养基用过膜陈海水配制。

营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，去离子水1 L，pH 7.4。

脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基：脑心浸粉17.5 g（小牛脑浸粉12.5 g，牛心浸粉5.0 g），D-葡萄糖2.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钠2.5 g，琼脂15.0 g，，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4。

MRS培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

以上培养基配制完均在121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

MLS-3020高压灭菌器：SANYO公司；JA2603B 电子精密天平：上海精科天美贸易有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏洁医疗器械有限公司；MO-2270M1海尔微波炉：海尔集团；MT-180B恒温培养箱：新苗医疗器械制造有限公司；R-100旋转蒸发仪：瑞士步琦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 海洋微生物的分离和纯化

分离自北冰洋沉积物样品中的菌株，采用涂布平板法[15]。取0.5 g沉积物样品，放入9倍体积的陈海水，待样品充分分散后静置使杂质沉淀。采用陈海水梯度稀释样品上清液，分别选取稀释度为10-4～10-7的稀释液50 μL涂布于LB海水固体培养基。28 ℃条件下培养。重复平板划线既得到纯化的单菌株，标号并进行保藏。

1.3.2 大肠杆菌拮抗菌株的初筛

初筛是采用对峙培养法进行筛选的[15]。将大肠杆菌培养液以0.1%（V/V）的接种量接种于LB培养基中，充分摇匀后倒平板，待凝固后，将得到的分离纯化后的菌株划线于培养基上，置于37 ℃条件下培养12 h，观察是否有抑菌带，即作为初筛菌株。

1.3.3 大肠杆菌拮抗菌株的复筛

参考张静楠等[16]的方法，将上述初筛获得的菌株按0.1%（V/V）的接种量接种于LB海水液体培养基中，37 ℃、180r/min条件下培养3～4d，得到的发酵液在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液旋蒸浓缩，并经0.22 μm无菌微孔滤膜过滤，得到浓缩发酵液。

检测浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌活性，采用琼脂扩散法[16]。将大肠杆菌按0.1%（V/V）的量接种于LB培养基中，在凝固的平板中打9 mm的琼脂圆孔，每孔中加入300 μL浓缩发酵液，用超纯水作空白对照。37 ℃培养12 h。量取抑菌圈直径，平行实验3组。

1.3.4 菌株的鉴定

对菌株进行形态观察，分析其生理生化结果。参考《伯杰细菌鉴定手册》[17]和《常见细菌系统鉴定手册》[18]对其进行归属分类。菌体进行固定、脱水、干燥后喷金进行扫描电镜观察[19]。

分子生物学鉴定：菌株于28 ℃在LB海水培养基上培养1 d。用加热法提取菌株脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）模板，分别取10 μmol/L的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'）对其16S rDNA序列进行PCR扩增。体系：总体积为50 μL。模板取1 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，5 U/μL的rTaq酶0.25 μL，细菌通用引物27 F、1492R各取1 μL，10×Loading Buffer 4 μL，剩余加无菌双蒸水41.75 μL。条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火50 ℃30 s，72 ℃延伸1 min，循环以上条件30次；完成后72 ℃延伸10 min。于4 ℃保存。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至大连宝生物公司进行测序，将测序结果与美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的数据库进行比对，选取比对后菌株的16S rDNA序列，结合MEGA 6.0软件描绘菌株的系统发育树，对其进行归属分类[20]。

1.3.5 抑菌谱的测定

制备浓缩发酵液方法同1.3.3。

采用琼脂扩散法检测浓缩发酵液对8种病原微生物的抑菌活性。其中特殊的肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌分别用NB、BHI、MRS培养基；其余均用LB培养基。

培养基中接入100 μL病原微生物，混匀后倒平板，待平板凝固后打孔，孔中加入300 μL粗发酵液，37 ℃培养12 h，量取抑菌圈直径。平行实验3组。

2 结果与分析

2.1 海洋微生物的分离结果

通过平板划线法筛得97个单菌落，根据形态观察，其中细菌偏多，分离得真菌8株。

2.2 大肠杆菌拮抗菌筛选结果

经对峙培养，筛选出21株对白色念珠菌有明显抑制性的菌株。采用琼脂扩散法进行复筛，抑菌效果见图1。

图1 105号菌株发酵液抑制大肠杆菌效果Fig.1 Effect of strain NO.105 fermentation liquid against Escherichia coli

由图1可知，105号菌株的抑菌圈最大，抑菌圈直径达（19.3±1.0）mm。

2.3 菌株的鉴定结果

2.3.1 形态学鉴定结果

图2 105号菌株的形态学鉴定结果Fig.2 Morphological identification results of strain NO.105

由图2可知，105号菌株在LB培养基上为不透明菌落，颜色呈黄白色，边缘不整齐，有褶皱，镜检观察为革兰氏阳性菌，产芽孢。

2.3.2 生理生化实验鉴定结果

表1 105号菌株的生理生化鉴定结果Table 1 Results of physiological and biochemical identification of strain NO.105

由表1可知，105号菌株柠檬酸盐实验、硝酸盐实验、V-P实验、淀粉水解实验、接触酶实验、明胶液化实验、葡萄糖产气实验均呈阳性；吲哚实验、甲基红实验、H2S实验和尿素实验均呈阴性。根据比对初步判定菌株属芽孢杆菌属（Bacillus）。

2.3.3 菌株系统发育树的构建

图3 基于16S rDNA序列105号菌株PCR扩增产物的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of PCR amplification products strain NO.105 based on 16S rDNA sequence

由图3可知，105号菌株与标准菌株Bacillus atrophaeus聚于一支，亲缘关系最近，因此，鉴定菌株105为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。

2.4 抑菌谱测定结果

抑菌谱测定结果如表2所示。

表2 105号菌株的抑菌谱Table 2 Antimicrobial spectrum of strain NO.105

由表2可知，105号菌株对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌的抑菌圈直径分别为（19.0±1.0）mm、（17.8±0.2）mm、（15.5±0.4）mm、（19.4±0.7）mm均有不同程度的抑制作用，抑菌谱广泛；但对副溶血弧菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌无抑制作用。

3 结论

本实验从北冰洋沉积物中分离并筛选出对大肠杆菌具有良好拮抗作用的菌株。分离得97株菌株，21株菌株对大肠杆菌有一定的拮抗作用，且1株菌株拮抗效果最好，编号为105号，其抑菌圈直径为（19.3±1.0）mm。进而将该菌株通过16S rDNA测序鉴定，结合菌株系统发育树证明该菌株为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。其对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等均有不同程度的抑制作用，抑菌谱广泛。

近年来，从天然资源中开发新型有效化合物已成为研究的趋势，海洋微生物特殊的生存环境，有可能产生结构新颖的活性物质。本实验中筛选出的105号菌株，来源于特殊的生存环境——北冰洋，后续研究正在进行中。