鹅源鼠伤寒沙门菌的分离鉴定及药敏试验

孔 铭,高 尚,徐 磊,王彦红,王晓泉

(1. 扬州大学兽医学院,江苏扬州225009 ； 2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州225009)

沙门菌是肠杆菌科的重要成员，革兰阴性杆菌，是重要的人兽共患病原体，在兽医学和医学上都具有重要的公共卫生学意义。其血清型多达2 600种以上[1]，其中鼠伤寒沙门菌(SalmonellaTyphimurium)隶属于沙门菌B群，是目前世界上分离率最高的菌型之一[2]，也是导致家禽传染病的常见菌之一。鼠伤寒沙门菌严重影响畜禽的生长发育，降低其商品价值，给养殖业造成巨大的经济损失，其临床症状常表现为胃肠炎或败血症两类。目前临床上常选择抗生素治疗细菌性疾病的同时，也导致了抗生素耐药菌株数量逐年增加。本试验对临床分离的鼠伤寒沙门菌进行了鉴定，并对其耐药性进行了初步分析，为科学防治沙门菌病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 用市售的绵羊血和普通营养琼脂粉按标准配方自行配置血琼脂培养基、麦康凯培养基；沙门菌属诊断血清，购自中国生物技术集团公司兰州生物制品研究所。

1.2 病料来源 2017年在扬州大学动物医院畜禽门诊部收到4例送检的病死鹅，具体如下。

E1：2017年3月江苏扬州某养殖者共饲养1 000只鹅，7日龄开始发病，用氟苯尼考饮水1 d，曾2次注射小鹅瘟疫苗，送检5只，剖检发现肝土黄色，脾肿胀，粪便红色，肺部有霉菌结节。采取肝组织以备用。

E2：2017年4月江苏扬州某养殖者共饲养1 000只鹅，10日龄出现死亡，15日龄送检5只，剖检发现小肠黏膜水肿、充血，伴有痛风症状。采取肝组织以备用。

E3：2017年5月江苏扬州某养殖者共饲养1 000只鹅，10日龄出现死亡，死亡200只，15日龄送检6只，剖检发现胃肠黏膜肿胀，呈弥漫性紫红色，伴有痛风症状。采取肝组织以备用。

E4：2017年12月淮安涟水县某养殖者共饲养4 000只，9日龄出现死亡，每天死亡20～30只，并开始用药，但用药不祥。14日龄送检病死鹅6只，剖检主要症状为心包炎、肝周炎、气囊炎。采取肝组织以备用。

1.3 细菌分离 采集病死鹅的肝脏和脾脏，无菌接种于血平板上，倒置放于37 ℃温箱中培养24 h。无菌挑取单个菌落分别接种于血平板和麦康凯平板上进行纯化传代。

1.4invA基因鉴定 本试验利用PCR扩增的方法进行沙门菌的鉴定。将分离株采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模板，参考文献[4-5]合成具有种属特异性的沙门菌特异性蛋白invA基因引物。PCR反应体系为 25 μL：10×LA PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture 0.5 μL、Taq聚合酶 0.25 μL、DNA 模板 2 μL、上下游引物各 0.25 μL，加入灭菌双蒸水至 25 μL。PCR 程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30s，52 ℃退火45s，72 ℃延伸1 min，进行25个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃ 5 min。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 生化试验 用接种环挑取纯培养的单个菌落分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、硫化氢、靛基质、M.R.、V-P、硝酸盐还原对照生化管中，于 37 ℃温箱中培养 24 h。根据生化反应对照管进行判定。

1.6 血清型试验 采用玻板凝集试验，挑取血平板上的单个待检菌落使用沙门菌O抗原多价A-F群血清进行鉴定，设立生理盐水为对照组。若出现凝集，则待检菌属于O抗原A-F群，依次用A-I群O抗原单价诊断血清判断待检菌O群，依据各O群所具有的单价因子依次对待检菌进行玻板凝集试验确定其O抗原血清型，并结合待检菌与H抗原诊断血清的玻板凝集试验结果最终判断其血清型。

1.7 药敏试验 采用Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法进行药物敏感试验。选用15种药敏纸片，包括多黏菌素B、庆大霉素、头孢曲松、多西环素、丁胺卡那霉素、诺氟沙星、氟苯尼考、复方新诺明、卡那霉素、链霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美洛西林、新霉素。挑取纯培养菌株均匀涂布于普通营养琼脂上，无菌取药敏纸片均匀贴于平板琼脂面上，置于37 ℃培养24 h后，用测量尺测量抑菌圈的直径。15种药物判断标准参考美国临床实验室标准委员会(NCCLS,2005年)药敏纸片扩散法。

2 结果

2.1 细菌分离 4份病料在血琼脂平板上形成透明的菌落，在麦康凯培养基上生长良好，形成无色、光滑、圆形的菌落。挑取单个纯培养后的菌落于载玻片上进行革兰染色，镜检分离菌为红色直杆状，大多散在或成对存在。分离菌株分别为E1、E2、E3和E4。

2.2invA基因鉴定 根据PCR扩增结果显示，4株分离菌均扩增出与预期大小相符的330 bp的目的条带(见图1)，分离株均为沙门菌。

图1 鼠伤寒沙门菌invA基因PCR扩增产物
Fig.1 Amplification products of theS. typhimuriuminvAgene PCRM:100 bp DNA Marker; 1～4: 样品; 5: 阳性对照 M:100 bp DNA Marker; 1～4: Sample; 5: Positive control

2.3 生化试验 结果显示，4株分离菌均能发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露醇，不发酵乳糖和蔗糖，能还原硝酸盐，吲哚试验阴性，M.R.试验阳性，V-P试验阴性，不分解尿素，均能产生H2S，生化试验均符合沙门菌特点。

2.4 血清型分型 4株分离菌均能与O4、O5、O12因子、H1、H2抗原血清发生凝集。因此，4个分离株的血清型均为[4,5,12∶i∶1,2]，与鼠伤寒沙门菌的抗原模式一致，因此4株分离菌均为鼠伤寒沙门菌。

2.5 药敏试验 药敏试验结果(表1)显示：4株分离菌均对诺氟沙星、头孢曲松、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素等敏感，均对多西环素和多黏菌素B耐药。除此之外，E2分离菌对复方新诺明耐药；E4分离菌对链霉素耐药，因此，这2株细菌表现出多重耐药性。

表2 4株分离菌对不同药物的耐药情况Table 2 Resistance of 4 isolates to different drugs

3 讨论

本试验所分离到的4株细菌，均来自2017年4个 养殖场所送检至扬州大学动物医院畜禽门诊部的病料。这些细菌经过PCR试验和生化试验鉴定，均为沙门菌，通过血清型鉴定后，4株分离菌均为鼠伤寒沙门菌。鼠伤寒沙门菌是引起禽副伤寒疾病的主要病原体，且能感染各种动物和人类，其感染率和发病率均较高，可导致暴发性食物中毒[6]，具有一定的公共卫生学意义。禽沙门菌病可以垂直传播。此外，污秽潮湿的环境、畜舍堆积粪便不及时清理、拥挤、通风不良、温度湿度相差过大等均能加快鼠伤寒沙门菌的传播。因此，加强平时的饲养管理，消除发病诱因，对种蛋进行严格消毒，加强育雏间的保暖等，可以在一定程度上预防本病的发生。

目前，临床上大多采用抗生素治疗细菌性疾病，感染鼠伤寒沙门菌也不例外。也正是因为地区生态环境以及养殖场饲养管理的差异，盲目使用不同种类的抗生素，导致沙门菌耐药性不断上升，耐药谱不断的扩大，多重耐药菌株的数量不断增加。沈学怀等[7]报道中所分离到的2株禽源鼠伤寒沙门菌表现出7重，甚至10重的严重耐药性。本试验药敏试验结果表明，此次分离的鹅源鼠伤寒沙门菌对氟喹诺酮类药物诺氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星，β内酰胺类药物头孢曲松，氨基糖苷类药物庆大霉素、妥布霉素敏感。因此，这些药物可以作为送检养殖场防治鹅源鼠伤寒沙门菌的首选药物，减少其他抗生素药物的使用，同时给予维生素，提高畜禽免疫力，降低畜禽鼠伤寒沙门菌病的发病率，从而降低死亡率。此外，具有多重耐药性的E2、E4菌株所在的养殖场，普遍存在因长期、大量使用抗生素的现象。综上，鼠伤寒沙门菌的治疗要建立在严格的药敏试验结果的基础上，选择抗生素要从其种类、质量、剂量、疗程和药效等方面考虑，切勿凭借以往的治疗经验，进行给药治疗。同时，一旦发现类似鼠伤寒沙门菌的症状时，应当及时就诊。