茶树花香气及茶叶气味对中华蜜蜂的引诱效应

吴国火,崔 林,王梦馨,李红亮,韩宝瑜

中国计量大学生命科学学院,浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室, 杭州 310018

植物挥发物在植物与昆虫之间的信息交流过程中起着重要作用,对昆虫的寄主植物定向行为、昆虫产卵行为、寄生蜂的寄主寻找行为等产生影响[1]。如番茄叶挥发物对B型烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)具有行为导向作用[2],茶梢挥发物可引诱假眼小绿叶蝉Empoascavitis(Göthe)[3],蝉害诱导的茶梢挥发物可引诱天敌昆虫叶蝉三棒缨小蜂StethyniumempoascaeSubba Rao、微小裂骨缨小蜂SchizophragmaparvulaOgloblin寄生[4-5]。植物挥发物也密切影响着昆虫的传粉行为[6],许多植物在开花期间,由花朵释放出多种挥发性物质,如丁香酚、苯酚等,这些挥发性化合物对传粉昆虫具有强烈的引诱作用,诱导传粉昆虫对蜜源做定向飞行[7]。

中华蜜蜂Apisceranacerana是我国特有的资源蜂种[8],其长期适应我国的气候条件,易于发现分散、零星开花的植物花粉,在维持生态平衡方面具有重要意义；其低温出巢的生活习性恰适宜于高寒地区以及早春和晚秋等低温条件下开花植物的传粉[9]。目前,对中华蜜蜂化学通讯的研究主要集中在蜜蜂自身腺体分泌的信息素[10],如工蜂那氏腺释放的气味具有引导和定向其他工蜂的作用[11]。生活中很早就发现植物挥发物尤其是花香,对蜜蜂具有引诱作用[12], Liu等[13]发现中华蜜蜂可识别植物花粉气味中的酚类物质含量,对低酚性物质含量的植物花粉具有偏好性,但总体来说有关植物挥发物引诱蜜蜂的研究较少。

我国茶园面积已达300 万hm2,约占世界茶园面积60%,因此茶树花资源非常丰富[14]。茶树花香气清香略带甜味,是秋冬季理想的蜜源。10月下旬茶树花盛开,成群的蜜蜂涌入茶园,茶树花展示了强大的引诱潜能。如果筛选出对蜜蜂有显著引诱作用的茶树花香气组分和茶叶挥发性组分,则可更好地理解茶树花引诱蜜蜂蜂群的机理,还能使用这些成分调控蜜蜂采集茶树花蜜,提高访花蜜蜂数量和访花频率,以便充分开发茶树花资源,增加单位面积茶园的经济效益。为检测中华蜜蜂对茶树花香气及茶叶气味的行为反应,本研究选用鉴定于茶树花和茶鲜叶的挥发性组分作为味源,用Y形嗅觉仪测定其行为反应,期望筛选出能显著调控中华蜜蜂行为的组分,以揭示茶树花引诱中华蜜蜂的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试昆虫：实验用中华蜜蜂取自中国计量大学蜂场,实验前禁食0.5 h。室内生物测定时随机选用工蜂。

供试茶树花味源：供试茶树种植于中国计量大学实验茶园(北纬30°19′29.90″,东经120°21′19.16″,海拔11 m),树龄皆为5年；使用8个国家级茶树良种(表1),即‘安吉白茶’、‘中茶108’、‘茂绿’、‘龙井43’、‘乌牛早’、‘鸠坑早’、‘铁观音’和‘金观音’,其在我国长江中下游地区皆有大面积种植。取其茶树鲜花作为味源,设0.25 g、0.50 g、1.00 g、2.00 g、3.00 g、4.00 g和5.00 g 共7个剂量。以洁净空气为CK。

供试化合物味源：从茶树花香气[15-18]中选择主要的、含量较大的27种组分(表2),选择茶叶挥发性化合物[19-20]中比较重要的24种组分(表3),这51种化合物购自Sigma公司,纯度≥98%。以液体石蜡为溶剂将每种化合物配成10-6g/mL、10-4g/mL和10-2g/mL 3 个剂量,其中苯乙酮、芳樟醇、α-法尼烯、顺- 3-己烯-1-醇和吲哚配成10-10g/mL、10-8g/mL、10-6g/mL、10-4g/mL和10-2g/mL 5 个剂量进行测定。每次行为测定时,分别吸取每个剂量的1 mL溶液作为味源,以1 mL液体石蜡作为CK。

1.2 Y形嗅觉仪及测定程序

Y形管由无色透明玻璃制成,两臂与基部长度皆为15 cm,内径为1.5 cm,两臂夹角为120°。两臂分别连接味源瓶(或对照瓶)、加湿瓶、空气过滤瓶(内装满已活化的活性炭)和流量计,各部件之间以Teflon管连接[21]。测定时分别吸取 1 mL 味源于开口的安碚瓶,开口安碚瓶置于味源瓶中；再吸取液体石蜡 1 mL 于开口安碚瓶中,置开口安碚瓶于对照瓶中。用气泵从Y形管基部管口抽气,测定时调节每臂流量为120 mL /min。测定前先抽气10 min,使Y形管味源臂中充满待测气味。测试时用试管将1头中华蜜蜂从Y形管基部管口引入。蜜蜂进入之后,则逆风行进,或直线爬行,或螺旋式行进,在Y形管交叉处做一个选择,进入Y形管的一臂,爬行5 cm记为选择该臂,超过5 min 无反应则不计数。

51种味源的每个处理剂量分别测定20头中华蜜蜂,每头只用1次；每测试10头,用无水乙醇擦洗Y形管内外壁,烘干,调换Y形管两臂与味源瓶和对照瓶的连接位置,用于消除Y形管可能的不对称而造成的影响。每个剂量的味源测定结束后,将 Y 形管、味源瓶等玻璃部件用重铬酸钾洗液清洗,于 100℃烘箱内烘干。活性炭在80℃烘4 h以解除其吸附的异味分子。

生物测定在暗室内执行,Y形管上方1.5 m处有1盏15W白炽灯提供照明。每天生物测定时间从8: 00至16: 00,这期间该蜂比较活跃。室温25℃,相对湿度(70±3)%。

1.3 数据分析方法

使用 SPSS 22.0软件完成数据分析。对中华蜜蜂进行室内 Y 形管嗅觉行为测定时,假设供试味源对于中华蜜蜂行为没有影响,则中华蜜蜂趋向味源和CK的概率均为50%,则有假设测验H0= 50∶50,对于该蜂趋向味源和CK的数量差异作χ2测验,当P<0.05 时,则差异达显著水平,当P<0.01 时,则差异达极显著水平。

2 结果和分析

2.1 8个茶树品种茶树花气味引诱中华蜜蜂的效应

以8个良种茶树的鲜花作为味源,洁净空气为CK,当味源剂量从 0.25 g、0.5 g、1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g递增至5.0 g时,‘安吉白茶’品种茶树花对中华蜜蜂的吸引效果逐渐增强,当味源剂量为3.0 g时引诱的蜜蜂数与CK引诱的蜜蜂数的差异达显著水平,味源剂量再增加时其吸引力逐渐下降。随着味源剂量的增加,‘中茶108’品种茶树花的吸引效果也逐渐增强,当味源剂量达到2.0 g时,其引诱效果达显著水平,之后引诱力下降。‘茂绿’品种茶树花对于蜜蜂的引诱效果也随着其剂量的增加而逐渐增强,当味源剂量达到0.5 g时,其引诱的蜂数与CK之间的差异显著,其后吸引力下降。而‘龙井43’品种茶树花供试剂量为0.25 g时,引诱效果与CK之间的差异显著,其后随着茶树花剂量的增加,吸引效果逐渐下降,当茶树花剂量为4.0 g或5.0 g时,与CK相比则具有显著的排斥效应。‘乌牛早’、‘鸠坑早’、‘铁观音’和‘金观音’品种的茶树花剂量为0.25 g时,对中华蜜蜂引诱效应与CK的差异显著,随着剂量的增加,吸引效果趋于下降,其中‘乌牛早’茶树花剂量为5.0 g时,对供试蜜蜂还有排斥效应(图1)。

图1 Y 形管嗅觉仪测定的8个品种茶树花与洁净空气引诱的蜜蜂数及其差异Fig.1 Difference between number of bees choosing each of eight tea cultivar flowers and number of bees choosing fresh air during Y-tube olfactometer bioassay *茶树花与洁净空气引诱蜜蜂数量之间的差异性达显著水平

8个品种茶树花用作味源,在低剂量时吸引供试蜜蜂,随着剂量的增加,引诱效应增强,到一定剂量时引诱效应与CK引诱效应之间的差异达显著水平；之后,茶树花吸引效果趋于下降。假设选择茶树花的中华蜜蜂数为y,供试茶树花剂量为x,则有选择 8个品种茶树花的中华蜜蜂数与供试味源剂量之间的关系式(表1)。

表1 选择8个品种茶树花的中华蜜蜂数与供试茶树花剂量之间的相关性

2.2 茶树花香气组分和茶叶挥发性组分引诱中华蜜蜂的作用

27 种茶树花香气组分中,苯乙酮(10-6g/mL)、芳樟醇(10-6、10-2g/mL)、莰烯(10-4g/mL)、顺- 3-己烯-1-醇(10-10g/mL)、α-法尼烯(10-2g/mL)、癸醛(10-6g/mL)、β-紫罗兰酮(10-6g/mL)、亚油酸(10-4g/mL)、顺-2-戊烯-1-醇(10-4g/mL)和苯甲醛(10-2g/mL)对中华蜜蜂引诱效应与CK(液体石蜡)诱效之间差异达到显著水平(P<0.05)。α-法尼烯(10-6、10-4g/mL)和亚油酸(10-2g/mL)对中华蜜蜂引诱效应则达到极显著水平(P<0.01)。随着供试剂量的增加,水杨酸甲酯、橙花醇对中华蜜蜂引诱力下降,在剂量为10-2g/mL时皆显示显著排斥作用(P<0.05),其中水杨酸甲酯达到极显著水平(P<0.01)；辛醛(10-6g/mL)也表现出显著排斥作用(P<0.05) (表2)。

表2 Y形嗅觉仪检测的茶树花27个主要香气组分与液体石蜡引诱中华蜜蜂数量的差异性

24个供试茶叶气味组分中,十八醇(10-4g/mL)、正辛醇(10-2g/mL)、吲哚(10-6g/mL)、薄荷醇(10-6g/mL)、薄荷酮(10-4、10-2g/mL)对中华蜜蜂引诱效应与CK(液体石蜡)之间差异达显著水平(P<0.05),柠檬醛(10-2g/mL)、β-石竹烯(10-4g/mL)则达到极显著引诱水平(P<0.01)。邻甲苯酚(10-2g/mL)、香茅醇(10-6g/mL)、1, 3-丙二醇(10-2g/mL)、α-松油烯(10-6g/mL)、正戊醇(10-4g/mL)则表现出显著排斥作用(P<0.05)(表3)。

表3 Y形嗅觉仪检测的茶鲜叶24个重要挥发性组分与液体石蜡引诱中华蜜蜂数量的差异性

3 讨论

本研究选用了8个大面积栽培的茶树良种,以它们的鲜花为味源,检测中发现低剂量鲜花引诱中华蜜蜂；随着剂量的加大,引诱效应增强,当剂量达到一定阈值时茶树花引诱效应与洁净空气引诱效应之间差异达显著水平；之后,茶树花剂量再增加,引诱效果则下降,个别品种茶树花甚至显现了排斥效应；味源质量与其引诱的蜜蜂数之间相关性显著。本研究也还发现茶树花香气主要组分、茶鲜叶挥发物重要组分对于中华蜜蜂的引诱效应也显示出类似的反应趋势。亦即在确定空间内,随着味源剂量的增加,供试昆虫做出有规则的趋向反应。潘铖等[4]用Y形管嗅觉仪检测了叶蝉三棒缨小蜂对于健康茶梢嫩茎、叶蝉口针刺吸和产卵管刺伤茶梢嫩茎、机械刺伤茶梢嫩茎等多种味源的多个剂量的趋向反应,皆获得了与此类似的行为反应。本课题组从拥有近3000份茶树种质的国家茶树资源圃(杭州)挑选了在长江中下游地区和华南地区广泛种植的23个茶树良种,从这23个良种香花中鉴定了79个香气组分,发现在每个品种鲜花中苯乙酮和芳樟醇相对含量皆分别超过鲜花香气总含量20%[15]。苯乙酮和芳樟醇的含量不仅分别超过了茶树花香气总量的20%,而且二者皆显著地吸引中华蜜蜂。成片茶园开花过程中,散发的浓烈香气和茶鲜叶气味招引着中华蜜蜂,尤其是其中的苯乙酮和芳樟醇等组分。这是茶树花引诱中华蜜蜂的主要原因之一。

本研究发现,苯乙酮和芳樟醇在10-6g/mL的低剂量便可显著引诱中华蜜蜂。β-紫罗兰酮、莰烯、Z- 3-己烯-1-醇、α-法尼烯、癸醛、亚油酸、Z-2-戊烯-1-醇和苯甲醛也显著地引诱中华蜜蜂。然而,水杨酸甲酯、辛醛和橙花醇3个组分显示了排斥效应。本研究检测的24个茶鲜叶挥发物中,十八醇、正辛醇、吲哚、薄荷醇、薄荷酮、柠檬醛和β-石竹烯对中华蜜蜂有显著或极显著引诱效应；正戊醇、邻甲苯酚、香茅醇、1, 3-丙二醇、α-松油烯5个组分则表现出显著排斥作用。香叶醇、橙花醇对中华蜜蜂引诱作用没有达到显著水平；柠檬醛在10-2g/mL剂量时对中华蜜蜂有显著吸引作用,这与已有的研究结果一致[22]。我们课题组发现AcerCSP3 可能作为中华蜜蜂触角化学感受系统的一部分,在搜寻某些植物花粉蜜源时其作为气味分子运载体而发挥一定的作用,其中β-紫罗兰酮与AcerCSP3具有较强的竞争结合能力[23]。β-紫罗兰酮和中华蜜蜂普通气味结合蛋白AcerASP2的气味识别力和结合力远大于水杨酸甲酯、香叶醇与AcerASP2竞争结合力[24]。β-紫罗兰酮与中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1也有较强结合能力,为蜜蜂偏好性气味[25]。分析认为,本研究中茶树花和茶鲜叶挥发物中引诱中华蜜蜂的组分质和量皆显著多于排斥中华蜜蜂的组分,茶树花香气和茶鲜叶气味显著引诱中华蜜蜂。

植物挥发物是由多种低浓度的挥发性次生代谢产物组成的混合物[26-28],昆虫行为受多种挥发物的协同影响。因此,需要将多种单一挥发性组分按其相互间自然比例配成混合物,再测其引诱效果[29- 30]。本组将选择显著引诱蜜蜂的组分,按不同比例配制多种备选引诱剂,结合色板等视觉引诱技术于茶园中进行诱效检测,期望筛选出高效的中华蜜蜂引诱剂,用于蜜蜂行为的调控。