NPR1 调控植物抗病机制及功能研究进展

刘琳琳，甄军波，刘迪，欧阳艳飞，迟吉娜

（河北省农林科学院棉花研究所/ 农业农村部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室，石家庄050051）

植物抗病基因在植物识别病原菌和抗病信号传导的病害防御过程中起重要作用。 近年来，利用转座子标签技术、定位克隆和抗病基因同源序列法等从植物中克隆到大量的抗病基因。这些基因的克隆、 鉴定和功能分析对于深入研究植物抗病机制、通过基因工程提高植物抗病性具有十分重要的意义。NPR1 基因（Nonexpressor of pathogenesisrelated gene 1），又被称为NIM1，在植物抗病性中起核心调控作用， 是植物抗病信号网络中的关键。研究者发现拟南芥NPR1 基因突变体npr1 表现出感病性增强， 系统获得抗性 （Systemic acquired resistance,SAR）响应的病程相关基因（Pathogenesisrelated gene,PR） 的表达量降低， 特别是PR1 和PR5[1-2]。而在突变体npr1 中表达NPR1 基因能够恢复拟南芥的抗病性和PR基因的表达水平[3]。 这项发现揭开了植物抗病基因工程中NPR1 基因研究的序幕。目前已经发现了6 个拟南芥NPR1 蛋白同源类似物，分别命名为NPR1～NPR6，关于NPR1、NPR3 和NPR4 参与植物抗病的研究较多，而NPR5 和NPR6 在植物抗病方面并未表现出显著作用。笔者下面主要围绕NPR1 基因参与植物抗病作用机制、转NPR1 基因作物的研究现状等进行论述。

1 NPR1 基因在植物抗病中的作用机制

1.1 NPR1 在抗病信号转导途径中的关键作用

不同的植物抗病信号转导途径中，关键信号分子有所不同。 水杨酸（Salicylic acid,SA）是SAR 的关键信号分子之一[1]，而诱导系统抗性（Induced systemic resistance, ISR） 的关键信号分子是茉莉酸（Jasmonic acid,JA）和乙烯（Ethylene,ET）[4]。不同的抗病信号转导途径中的信号物质既有区别，也存在一定的交叉。 NPR1 就是不同形式抗病信号转导途径中的交叉点之一，NPR1 在SAR 和ISR 中起核心调控作用，是植物防御信号转导途径中的重要调控因子， 调节SA 和JA/ET 信号反应中的交互作用（Cross talk）机制，能够协调和平衡信号转导途径的强弱[5-6]。 在SAR 途径中NPR1 作为SA 的受体，能够感知SA 信号从而形成抗病信号转导途径，使植物建立系统获得抗病性[7]。研究者发现，拟南芥突变体npr1 中介导ISR 的根际细菌诱导的系统抗性被阻断， 表明NPR1 在ISR 信号途径中起关键作用。ISR 途径中NPR1 下游的过程与SAR 途径中的不同[4]，SAR 需要NPR1 的核定位[8]，而ISR 需要NPR1 的胞质定位[9]，说明NPR1 根据植物抗病信号转导途径中的信号分子差异调节防御反应。目前NPR1 在SAR 中的作用机制的研究更为详细，下文将重点进行阐述。

1.2 NPR1 基因及其编码蛋白的结构特征

拟南芥NPR1 基因含有4 个外显子和3 个内含子。NPR1 基因启动子区含有多个W 盒（W-box），WRKY 蛋白识别W-box 调节NPR1 基因的表达，WRKY 与NPR1 之间存在相互影响和相互调控的关系[10]。 但目前对其启动子的研究相对较少。 拟南芥NPR1 基因启动子中存在3 个W-box，能与SA 诱导表达的WRKY 蛋白特异性结合， 在转录水平对NPR1 基因的表达进行调控[10]。对水稻中OsNPR1 基因起始位点上游1 005 bp 启动子区的顺式作用元件分析表明， 启动子区包含W-box 和ASF1，分别是转录因子WRKY 和亮氨酸拉链（bZIP）的结合域，这两个区域是SA 诱导SAR所必需的[11]。棉花中已经报道GbNPR1 基因起始位点上游有618 bp 的启动子区域，包含2 个W-box[12]，但关于其顺式元件分析和功能研究等均未见进一步报道， 有待深入研究。 最近的一项研究表明，NPR1 将细胞周期蛋白依赖性激酶8 （CDK8）和WRKY18 加入NPR1 启动子，不但促进了NPR1 表达， 还促进了RNA 聚合酶Ⅱ与NPR1 靶基因PR1启动子和其编码区的结合， 正调控其表达。 NPR1在SA 存在下，与RNA 聚合酶Ⅱ一起富集CDK8、WRKY18 和TGA 转录因子，从而促进自身表达以建立植物免疫的机制[13]。

AtNPR1 编码的蛋白含有至少4 个具有重要功能的锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats），这些序列存在于多种生物学功能复杂的蛋白中，并且可能参与蛋白与蛋白的相互作用[3]。AtNPR1 中有17 个半胱氨酸，其中10 个高度保守，表明NPR1 蛋白结构可能是氧化还原敏感的[14]。 NPR1 具有2 个对共激活功能非常重要的结构域——N 端的BTB/POZ结构域和C 端的反式激活结构域[8,15]。 BTB/POZ 结构域负责转录因子TGA 的共激活[15]。 NPR1 通过ankryin 重复序列与TGA 相互作用[16]。 与其他包含BTB 结构域的蛋白质 （如NPR3 和NPR4） 一样，NPR1 可以作为Cullin 3 （CUL3）E3 连接酶底物泛素化的衔接物。 然而并没有被发现NPR1 与Cullin 3直接关联， 并且依赖于NPR1 的E3 连接酶活性的底物还没有被确定[17]。 经SA 处理后，TGA-NPR1复合物的转录激活需要C 端的反式激活域和2 个必需半胱氨酸残基Cys-521 和Cys-529 的作用[15]。Cys-521 和Cys-529 是NPR1 与SA 的结合的关键组分[7]。C 端的二分核定位序列是SA 诱导的NPR1核定位和功能所必需的[8]。 研究表明，N 端的BTB/POZ 结构域通过物理作用抑制C 端的反式激活结构域，而SA 与NPR1 的结合通过构象变化破坏这种相互作用[7]。 也就是说，NPR1 的功能是通过依赖于与SA 直接相互作用的构象变化来实现的。

1.3 NPR1 在SAR 中介导的抗病机制

在SAR 途径中，NPR1 位于SA 等信号传导的下游、PR基因表达的上游， 是SAR 途径的1 个正调节基因，而且在单子叶和双子叶植物中可能存在类似的抗病途径[19]。在拟南芥中，NPR1 是1 种参与对病原侵染防御反应的蛋白质[3]。 NPR1 激活具有bZIP 的转录因子TGA 家族的1 个亚家族， 诱导PR基因的表达和SAR 的产生[19]。 NPR1 能够与TGA 家族的多个转录因子强烈互作， 通过增强其DNA 结合亲和力激活TGA 转录因子，TGA 转录因子能够与PR1 基因启动子中2 个分别正负调控的顺式作用元件中的任何一种结合，NPR1 的存在显著增强了这种结合。 由于TGA 结合的PR1 启动子的元件不同，NPR1 不仅可以激活基因转录，而且可以抑制基因转录，从而建立SAR[20]。 NPR1 与TGA 转录因子的互作同样在水稻和烟草中得以证实[18-21]。 NPR1 通过与转录调节因子TGA 形成核蛋白质复合物调控PR基因的表达。 NPR1 不仅能够调控PR基因的表达，还直接参与调节蛋白分泌相关基因的表达， 从而调节SAR 反应中PR 蛋白的分泌[22]。

在低SA 浓度下，S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对NPR1 中Cys156 进行S-亚硝基化会促使NPR1以其寡聚形式存在[23]。 NPR1 的寡聚形式主要存在于细胞质内[14]。 为防止SAR 相关基因的未诱导表达，NPR1 中Ser55/59 的磷酸化抑制了防御基因的表达[24]，NPR1 的N 末端BTB/POZ 结构域与C 末端反式激活域相互作用并抑制其功能[25]。 此外，NIMIN（NIM1 互作）蛋白与NPR1 相互作用以抑制基因表达[27]。NPR1 的旁系同源物NPR3 和NPR4与TGA2/TGA5/TGA6 相互作用，以进一步抑制转录[28]。NPR1 在Cullin 3 介导泛素化后被26S蛋白酶体降解[24,28]。

植物受病原侵染、 外施SA 或其类似物导致SA 在细胞中的积累改变了氧化还原状态， NPR1中Cys156 的减少导致NPR1 寡聚体的解体[14]。单体NPR1 然后通过二分核定位信号的作用转移至细胞核[8]。NPR1 中Ser11/15 的磷酸化导致更多NPR1被激活，从而增加SAR 相关基因的表达[24]。 SA 与NPR1 结合后，NPR1 的C 端反式激活结构域的构象改变， 降低了其对N 端BTB/POZ 结构域的抑制[25]。NPR1 的BTB/POZ 结构域与TGA 的N 端结构域相互作用，从而激活转录[15]。 SA 与NPR1 的结合也改变了其与NIMIN 的相互作用， 从而减轻了抑制作用[26]。 此外，SA 与NPR3/NPR4 的结合抑制SAR 相关基因的表达[27]。NPR1 基因由于启动子区的W 盒受到WRKY 转录因子的调控启动表达，打开NPR1 基因的转录活性区， 表达产物游离NPR1作为SA 的受体，通过配体-受体特异结合，改变构象， 与结合于PR1 启动子的转录因子成员（TGA）相互作用，促进DNA 的结合或调整复合物转化活性的功能， 促进下游PR1 蛋白的表达， 从而形成SA 介导的抗病信号转导途径， 建立植物的系统获得抗病性（图1）。

图1 SA 介导的植物NPR1 抗病信号转导途径模式

2 NPR1 基因在植物中抗病功能研究进展

研究者已经在不同植物中克隆了很多个NPR1 基因，NPR1 基因在植物抗病尤其是在SAR途径中的关键作用已经被大量的过表达研究所证实，能增强植物对多种活体营养型和死体营养型病原的抗性（表1），说明NPR1 基因在多个物种中存在功能保守性。在拟南芥中组成型表达AtNPR1 基因，转基因拟南芥对霜霉病菌（Peronospora parasitica）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性增强，PR 蛋白的表达量也有所提高[29]。AtNPR1 基因已分别被转入水稻、番茄、小麦、胡萝卜、柑橘、油菜、棉花，其中：转基因水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性明显提高[18,30]；转基因番茄不仅对番茄花叶病毒产生抗性，而且对多种真菌性和细菌性病害表现出广谱抗性[32]；转基因小麦对镰刀菌赤霉病抗性显著增强[33]；转基因胡萝卜对核盘霉等病菌的抗性均明显提高[34]；转基因柑橘对黄龙病和溃疡病的抗性增强[35-36]；转基因油菜表现出对丁香假单胞菌的抗性[37]；转基因棉花对黄萎病等多种土传性病害的抗性显著提高， 对肾形线虫的抗性也有明显提高[38]；Kumar 等报道了转AtNPR1 基因棉花株系对根串珠菌（Thielaviopsis basicola）引起的根黑腐病的抗性比对照明显提高[39]。 这些结果证明NPR1 基因是植物防御体系的重要组成部分。在多种作物中过表达AtNPR1 基因对基础防御基因的表达几乎没有影响，但响应时间明显增长，防御反应强度明显提高[35,37,39]。

表1 AtNPR1 基因及其同源基因在不同植物中的抗病类型

将克隆自水稻NPR1 基因的同源基因Os-NPR1/NH1 导入水稻后，其对白叶枯病抗性显著提高[40-41]。NH1 和AtNPR1 一样，在SA 和JA 介导的防御信号通路间的交互中起作用[40]。 但在水稻中过表达AtNPR1 和NH1 都产生了负面影响， 转At-NPR1 基因和弱光下生长的转NH1 基因水稻生长迟缓，植株矮小，出现了类病变的表型[31,41,47]。 这种效应同样存在于草莓中[48]，但在许多其他作物中不存在这种有害效应，这表明NPR1 的调节作用在不同物种间存在一些重要的差异。 Molla 等在水稻中组织特异性表达AtNPR1 基因提高了水稻对稻纹枯病的抗性，并且未引起水稻生长异常[31]。 Xu 等在AtNPR1 基因前加入TBF1 基因的免疫诱导启动子和2 个病原菌响应的上游开放阅读框，转入水稻后提高水稻对白叶枯病和稻瘟病抗性的同时，不影响水稻的正常生长[51]。

目前已经从多种植物中分离到了NPR1 的同源基因，并证实了这些基因的抗病作用。 过表达苹果MpNPR1 基因可增强苹果对火伤病和真菌病害的抗性， 并激活了一系列下游抗病相关基因的表达[42]。在葡萄中超表达VvNPR1 基因能够增强对白粉病的抗性，诱导PR 蛋白的积累[43]。 棉花中NPR1基因的克隆也已见报道。近年来已经分别在海岛棉和陆地棉中克隆到了NPR1 基因，研究结果表明，棉花NPR1 基因与其他作物NPR1 基因同源性不高，但其编码产物的功能结构域同源性较高[12,51]。Gb-NPR1 基因转化烟草后，利用离体叶片接种法对转基因烟草进行抗病性鉴定，结果表明转基因植株对烟草赤星病菌（Alternaria alternata）的抗性明显提高[12]。GhNPR1 基因受到茉莉酸甲酯（Jasmonic acid methyl ester,JA-Me）、SA 和乙烯的诱导，并在尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum） 和细菌性条斑病菌（Xanthomonas campestris）侵染中起防御作用[50]。 柴蒙亮等从海岛棉新海21 号克隆得到的GbNPR1基因在棉花抵御枯萎病菌侵染及植物抗病信号转导过程中起一定作用[51]。 在拟南芥npr1 突变体中表达油菜BnNPR1 基因能够恢复拟南芥对丁香假单胞菌的系统获得抗性和PR1 基因的诱导表达。在甘蓝型油菜中过表达BnNPR1 有效地增强了甘蓝型油菜对丁香假单胞菌的抗性，并且没有引起明显的发育异常，证实了NPR1 在拟南芥和甘蓝型油菜之间的功能保守性[38]。 大豆（Glycine max）中与AtNPR1 同源的GmNPR1-1 和GmNPR1-2 基因可增强大豆的广谱抗性。 在拟南芥npr1-1 突变体中表达GmNPR1 基因，转基因植株经2，6-二氯异烟酸处理和丁香假单胞菌侵染均能诱导PR基因的表达，大豆植株在受到侵染后表现出SAR 的激活，说明GmNPR1 对大豆抗病性的重要性[52]。 可可（Theobroma cacao）TcNPR1 基因具有与AtNPR1相似的功能，TcNPR1 蛋白与AtNPR1 一样，在SA处理后被转运到细胞核， 参与诱导PR基因的表达，说明其在可可的防御反应中发挥作用[53]。 过表达BjNPR1 的转基因芥菜株系通过启动PR基因的表达激活防御信号通路，对黑斑病（Alternaria brassicae）和十字花科白粉菌（Erysiphe cruciferarum）的抗性增强，不仅出现症状延迟而且病情减轻，表明SAR 被激活，BjNPR1 与真菌病原菌的广谱抗病性有关[44]。 Yu 等[45]从黑麦（Secale cereale）中分离到ScNPR1 基因，将其转化到中度赤霉病感病小麦品种中，发现转基因株系对赤霉病的抗性明显高于野生型，通过分析发现PR基因在早期的高表达可能是转基因株系对赤霉病抗性增强的原因。 转桑树MuNPR1 基因的拟南芥对丁香假单胞菌表现出更强的抗性[46]。在长春花（Catharanthus roseus）中沉默CrNPR1 基因显著抑制了长春花植株中CrPR1a 的诱导。在CrNPR1 沉默植株中长春花叶黄病发展很快，证明了NPR1 和SA 介导的防御作用在对抗长春花植原体中的重要性[54]。

3 展望

NPR1 基因在植物抗病机制中具有重要作用，能够增强植物对生物胁迫的耐受性。 由SA-NPR1介导的抗病途径在拟南芥中已经非常明晰，但仍有许多问题尚待解决，如NPR1 与其互作成分之间的关系和翻译后修饰需要进一步研究，这一途径在其他作物抗病过程中的作用还需要系统的试验验证。SAR 的诱导是一个涉及多种生理生化机制和大量基因的复杂系统。 NPR1 调节的程度和方式在不同物种之间可能存在差异，烟草NPR1 具有对SA 敏感的反式激活结构域[55]，在水稻中过表达NPR1 基因会自发激活防御基因的表达[41]，在水稻和草莓中防御反应的激活可能会对植物生长发育产生负面影响，影响作物生产相关的重要过程[31,49]，但在拟南芥和许多其他植物中不存在这种现象。在大量植物品种中，过表达AtNPR1 及其同源基因被证实能够增强植物的抗病性，说明了NPR1 在抗病中的保守作用。通过基因工程技术将NPR1 基因应用于植物保护是可行的。在相关作物中证实存在与拟南芥类似的SA-NPR1 介导的抗病转导途径，了解抗性诱导的生理和分子机制，以及在这种条件下抗性表达对适应性的影响， 将有助于植物抗病性的提高，在控制植物病虫害的绿色技术应用方面具有广阔的前景。