沙门菌血清型多态性与PFGE分型及其相关性研究*

施怡茹，赵锦江，卢晓芸，姚正原，陈洪友，徐秋芳△

上海市青浦区疾病预防控制中心，上海 201700；2.上海市疾病预防控制中心病原所检定所，上海 200336

沙门菌是一种常见的人兽共患病病原体[1]，可通过污染食物和水来感染人和动物，是引起食物中毒和食源性疾病的重要致病菌[2-3]。根据沙门菌菌体抗原(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)的不同，血清分型成为沙门菌分型最主要的分型形式。根据Kauffman-White抗原标准,到目前为止，沙门菌属已有超过2 700种血清型，而国内分离并报道的仅有300多种[4],其中流行的优势血清型有肠炎、鼠伤寒和德尔卑沙门菌等[5]。研究沙门菌的优势血清型别分布情况、分子分型等可以为沙门菌感染性腹泻的预防工作提供参考。

1 材料与方法

1.1试验菌株 沙门菌菌株收集时间为2015年1月至2018年12月，均分离自上海青浦区内各级医院腹泻门诊中初诊为疑似细菌性腹泻患者的粪便标本和肛拭子标本。患者主诉以腹泻症状为主，腹泻次数>3次/天，粪便性状异常，为水样便、稀便、黏液便或脓血便等。

1.2仪器与试剂 蛋白酶K、XbaⅠ限制性内切酶为Takara生物工程有限公司产品；SeaKem Gold琼脂糖粉为美国Cambraex Bio Rockland公司产品；Gelred染色液为美国Biotium公司产品；Vitek 2 GN生化鉴定板条为法国生物梅里埃公司产品；沙门菌诊断血清为丹麦国家血清研究院SSI、泰国S&A公司的产品；磺胺增菌液(SBG)、XLD平板、沙门菌显色平板、肠道综合生化鉴定管等相关增菌液和培养基均购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；采用法国生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统、美国伯乐公司CHEF Mapper脉冲场凝胶电泳仪、GELDocTMXR凝胶成像仪、美国Applied Maths公司BioNumerics 7.1分析软件。

1.3方法

1.3.1腹泻患者标本多病原菌的检测 收集疑似细菌性腹泻患者的粪便标本和肛拭子标本，按照《上海市腹泻病监测实施方案(2014年试行版)》中的标准操作规程对副溶血性弧菌、霍乱弧菌、志贺菌、沙门菌、致泻性大肠埃希菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌等7类肠道病原菌进行细菌学分离鉴定，所有分离菌株均由上海市疾病预防控制中心病原检定所复核鉴定。

1.3.2沙门菌血清分型 采用玻片凝集试验，血清型鉴定按照沙门菌血清诊断操作步骤进行，根据测得的抗原式确定沙门菌的血清型。

1.3.3脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因分型 参考美国CDC PulseNet USA的方法[6]。以H9812参考菌株作分子量标准，该菌株由上海市疾病预防控制中心提供，所有菌株均用XbaⅠ酶切，PFGE图谱用BioNumerics 7.1软件分析。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1血清型分布 本研究共收集到384株人腹泻源性沙门菌，分为34个血清型、10个血清群。主要血清群包括B群(34.60%)、C1群(13.80%)、D群(21.90%)和E1群(15.60%)，见表1。

表1 384株沙门菌的血清型分布情况

续表1 384株沙门菌的血清型分布情况

2.2各年份间的比较 2015年有20个血清型别，2016年29个，2017年19个，2018年17个。2015-2018年，各年份间鼠伤寒沙门菌构成比比较，仅2016年和2017年间差异有统计学意义(χ2=5.06，P<0.05)，其余各年份之间差异无统计学意义(P>0.05)。各年份间肠炎沙门菌构成比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 2015-2018年鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌的构成比

2.3PFGE聚类分型结果 收集的菌株中341株沙门菌完成了PFGE并运用Bio Numerics 7.1软件进行聚类分析，以Dice系数计算相似度，UPGMA法建树。基因组DNA片段得到较好分离，按1.0的相似系数，341株沙门菌产生了203种PFGE带型，按相似系数0.75分为73个聚类大簇。相同血清型的菌株基本具有相同的图谱型别或聚集在一起；存在部分沙门菌的血清型不同，但分型后仍表现出较高的基因同源性。

80株肠炎沙门菌产生28种带型，最优势的PFGE型有14株，与该带型相似性大于90%的有50株，该优势聚类共64株，占80.0%；77株鼠伤寒沙门菌产生54种带型；41株伦敦沙门菌产生17种带型，相似度大于85%的优势聚类有30株，占73.2%；17株德尔卑沙门菌产生13种带型；14株罗森沙门菌产生9种带型；12株婴儿沙门菌产生9种带型；5株纽波特沙门菌产生5种带型。

3 讨 论

2015—2018年上海市青浦区的沙门菌血清型别呈现多态性的特征，各年份优势血清型基本稳定，均以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为优势血清型，常见血清型为伦敦沙门菌、德尔卑沙门菌、罗森沙门菌、婴儿沙门菌等。同国内其他省市比较，虽然均以肠炎和鼠伤寒沙门菌最为常见，但青浦区亦发生了一定的血清型流行变迁[4]。

PFGE分型显示，流行的人源性沙门菌是多克隆的，由肠炎沙门菌的2种基因带型(1种聚类簇)和伦敦沙门菌1种基因带型的克隆株占主导。某些血清型的菌株具有较高的遗传同源性，基本位于同一聚类簇中，如肠炎、火鸡、阿贡纳、伦敦、姆班达卡等沙门菌，其遗传基因相对保守。某些血清型别的菌株分型后存在多种带型且同源性较低，如鼠伤寒、纽波特、乙型副伤寒、德尔卑、利奇菲尔德等沙门菌，呈现出较高的遗传多态性，与相关文献报道基本一致[5-6]。上述几种血清型别的沙门菌在多位点可变数目串联重复序列分型(MLVA)、PFGE、多位点序列分型(MLST)分析中，均呈现一致的遗传保守性或多态性[7]。有不同血清型别的菌株分型后仍表现出较高的基因同源性，在本研究的菌株中，有1株肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌的PFGE带型一致，2株汤卜逊沙门菌与婴儿沙门菌PFGE带型一致，该现象符合之前的文献报道[7-8]。

沙门菌的血清型别和PFGE分型之间存在一定的相关性，但并非完全对应。血清型别的鉴定作为沙门菌的分型分类方法已有80多年历史，现仍是国际微生物检测机构认定的微生物学初筛的标准方法之一，所以准确、快速的血清型鉴定对沙门菌引起疾病的防控具有重要的意义。PFGE被视为多种病原菌分子分型和溯源分析的“金标准”[9-10]，也可以为血清凝集试验或核实血清型别的准确性提供一定帮助。建立沙门菌的PFGE指纹图谱数据库，加强对流行克隆株和优势聚类的菌株，以及变异较大的菌株的实时监测和研究，有利于研究散发病例的菌株之间的基因型差异及联系，提高对传染病的预警能力，为食源性疾病暴发的追踪溯源和病原菌的确定提供有力的科学依据。