辛伐他汀抑制高糖损伤乳鼠心肌细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-p38 丝裂原活化蛋白激酶通路抑制心肌细胞凋亡

孙强，尉希清，张洪生，胡玲爱，宋秉春，张延春，张金国

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信号从细胞膜向细胞核传递的重要中介，在维持细胞生长、发育及凋亡等一系列行为和功能中发挥重要作用。近来研究[1-2]表明，高糖刺激能使氧化应激增强，生长因子及细胞因子表达增加，而这些变化可激活MAPK 家族，使其转录活性增强，参与糖尿病慢性并发症的发生。已有研究[3]表明，辛伐他汀对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化具有保护作用，但其具体作用机制、对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶-p38MAPK 通路的影响，目前尚少见报道。本实验通过建立高糖诱导乳鼠心肌细胞损伤模型，观察辛伐他汀对高糖损伤乳鼠心肌细胞NADPH 氧化酶-p38MAPK 信号通路及心肌细胞凋亡的影响，探讨辛伐他汀对高糖损伤心肌细胞的保护作用及其分子机制。

1 材料与方法

实验动物:新生1～3d 龄SD 大鼠，由苏州大学实验动物中心提供。实验大鼠的使用严格遵守动物实验的各项伦理条例。

药品及主要试剂：胎牛血清、改良伊格尔培养基（DMEM 培养基）(Gibco 公司，美国)；辛伐他汀（simvastatin）原粉（默沙东公司，美国）；牛胰蛋白酶、二甲基亚枫（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒（Sigma 公司，美国）；D-葡萄糖（巴斯夫化工有限公司，天津）；免疫沉淀（IP）裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒和半胱天冬氨酸蛋白激酶-3（Caspase-3）试剂盒（西唐生物科技有限公司，上海）；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（建成生物工程研究所，南京）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司，上海）；RNA 逆转录试剂盒及PCR 试剂盒（Fermentas公司，美国）；Western blot 试剂盒（KPL 公司，美国）；抗鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因内参（Millipore 公司，美国）；抗兔多克隆p38MAPK 抗体；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法（Cell Signaling 公司，美国）；细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒和抗鼠α-肌动蛋白（α-actin）单克隆抗体（博士德，武汉）。

实验分组:待培养72 h 心肌细胞生长稳定，搏动良好后按随机化原则分组并加入相应的干预药物，将心肌细胞随机分为五组：（1）用含有20%胎牛血清的DMEM 培养液继续培养72 h，不加任何刺激药物,为对照组；（2）含有20%胎牛血清的DMEM 培养液中加入终浓度为25 mmol/L 的葡萄糖继续培养72 h，为高浓度葡萄糖刺激组（高糖组）；（3）三组不同浓度的辛伐他汀干预组即含有20%胎牛血清的DMEM 培养液中加入终浓度为25 mmol/L 的葡萄糖及终浓度分别为10-7、10-6、10-5mol/L（M）的辛伐他汀继续培养72 h，分别为高糖+10-7M 辛伐他汀组、高糖+10-6M 辛伐他汀组、高糖+10-5M 辛伐他汀组。以上各组心肌细胞每个检测指标均设置六个复孔。

MTT 比色法测定心肌细胞活力:参照刘会等[4]的方法，用MTT 比色法测定心肌细胞活力，各组细胞活力=(各浓度组OD值/对照组OD值)×100%与之比较。

培养液内LDH 活力及SOD 活力测定：严格按试剂盒的说明书检测培养液中LDH 活力和SOD 活力。

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌细胞内NADPH 氧化酶亚基p22phox、p47phoxmRNA 表达：引物序列如下：p22phox 引物序列：正向引物：5'-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3'，反向引物:5'-TCACACGACCTCATCTGTCAG-3'，基因片段长度457bp；p47phox 引物序列：正向引物：5'-GCTCACCGAGTACTTCAACA-3'，反向引物：5'-GCCTTCTGCAGATACATG GA-3'，基因片段长度570bp；β-actin 引物序列：正向引物：5'-CACGATGGAGGGG CCGGACTCATC-3'，反向引物：5'-TAAAGACCTC TATGCCAACACAGT-3'，基因片段长度241bp。

Western Blot 检测各组心肌细胞p38MAPK 蛋白表达：用BCA 法[5]进行蛋白定量，应用1D 凝胶定量软件（BIO-RAD Quantity One） 4.6.2 软件对Western 条带进行半定量分析，以目的条带光密度/GAPDH 光密度作为表达强度的定量指标,计算各组蛋白的相对表达量。

乳鼠心肌细胞培养液中Caspase-3 浓度测定：Caspase-3 的活化是细胞凋亡的最终共同途径，可以反映凋亡发生的程度。采用ABC-Elisa 法测定培养液中Caspase-3 浓度，严格按Caspase-3 的试剂盒说明书步骤操作，用芬兰Thermo 公司Mμltiskan MK3酶标仪测定，单位μmol/L。

TUNEL 免疫荧光染色检测各组乳鼠心肌细胞凋亡情况：按试剂盒说明书通过免疫荧光染色测各组乳鼠心肌细胞凋亡数，细胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染成蓝色，凋亡细胞被染成绿色。

2 结果

心肌细胞形态学观察：培养72 h 后，台盼蓝染色随机取3 个视野观察，细胞存活率分别为98.4 %、97.6% 和97.2%。用α-actin 抗体检测证明心肌细胞纯度较高(图1）。对照组心肌细胞成簇生长，呈梭形、星形或不规则三角形，细胞伸出伪足，核呈卵圆形并居中，搏动规律有力，细胞搏动频率为60～120 次/min；高糖组心肌细胞皱缩变圆，伪足减少，细胞搏动频率增快；三组不同浓度的辛伐他汀干预组心肌细胞的生长状态较好，细胞形态明显好于高糖组，且贴壁细胞多于高糖组；高糖+10-5M 辛伐他汀组的细胞生长状态及细胞存活率要好于高糖+10-7M 辛伐他汀组，细胞的搏动频率明显慢于高糖组，搏动有力。随着辛伐他汀浓度的增加，细胞生长状态愈好，搏动频率愈慢。培养的各组心肌细胞形态见图2。

辛伐他汀对高糖刺激的心肌细胞活力、LDH 活力及SOD 活力的影响（表1）：与对照组比较，高糖组、高糖+10-7M 辛伐他汀组、高糖+10-6M 辛伐他汀组心肌细胞活力及SOD 活力明显降低，LDH 活力明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.01）；高糖+10-5M 辛伐他汀组心肌细胞活力、SOD 活力及LDH活力与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与高糖组比较，三组不同浓度的辛伐他汀干预组心肌细胞活力及SOD 活力明显升高，LDH 活力明显降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性（P＜0.05）。

图1 大鼠原代心肌细胞α-actin 免疫荧光鉴定（×20）

图2 培养的各组乳鼠心肌细胞形态图（×40）

表1 各组乳鼠心肌细胞活力、LDH 活力及SOD 活力的比较 (，n=6)

表1 各组乳鼠心肌细胞活力、LDH 活力及SOD 活力的比较 (，n=6)

注：心肌细胞活力=实验组吸光度值／对照组吸光度值 ×100%（吸光度通过MTT 法测得） 。M 表示mol/L，LDH：乳酸脱氢酶，SOD：超氧化物歧化酶。与对照组比较*P＜0.01；与高糖组比较△P＜0.05；与高糖+10-7M 辛伐他汀组比较▲P＜0.05；与高糖+10-6M 辛伐他汀组比较#P＜0.05

辛伐他汀对高糖刺激乳鼠心肌细胞凋亡的影响：通过TUNEL 染色检测辛伐他汀对高糖刺激乳鼠心肌细胞凋亡的影响，与对照组相比，高糖组TUNEL 阳性细胞（绿色荧光）显著增多，辛伐他汀干预后TUNEL 阳性细胞（绿色荧光）显著减少，且呈剂量依赖性（图3）。

辛伐他汀对高糖刺激时心肌细胞p38MAPK 蛋白表达的影响（图4）：与对照组比较，高糖组、高糖+10-7M 辛伐他汀组、高糖+10-6M 辛伐他汀组p38MAPK 蛋白表达显著升高（P均＜0.01），差异有统计学意义，其中高糖组p38MAPK 蛋白表达水平达对照组的2.6 倍；高糖+10-5M 辛伐他汀组p38MAPK 蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与高糖组比较，三组不同浓度的辛伐他汀干预组p38MAPK 蛋白表达显著下调，抑制率分别为12.3%、23.1%、61.5%，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈浓度依赖性(P＜0.05）。

辛伐他汀对高糖培养的心肌细胞培养液中Caspase-3 浓度的影响（表2）：与对照组比较，高糖组，高糖+10-7M 辛伐他汀组，高糖+10-6M 辛伐他汀组Caspase-3 浓度显著升高（P均＜0.01），差异有统计学意义，高糖+10-5M 辛伐他汀组Caspase-3 浓度与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与高糖组比较，三组不同浓度的辛伐他汀干预组Caspase-3 浓度显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈浓度依赖性(P＜0.05)。

辛伐他汀对高糖刺激时心肌细胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox mRNA 表达的影响（图5）：与对照组比较，高糖组、高糖+10-7M 辛伐他汀组、高糖+10-6M 辛伐他汀组NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表达显著上调（均为P＜0.01），差异有统计学意义；高糖+10-5M 辛伐他汀组NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表达与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与高糖组比较，三组不同浓度的辛伐他汀干预组NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表达显著下调，抑制率分别为21.7%、33.2%、52.2%及14.9%、34.6%、46.6%，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈浓度依赖性(P＜0.05）。

图3 TUNEL 染色检测各组乳鼠心肌细胞的凋亡细胞数 （×10）

图4 Western blot 分析各组乳鼠心肌细胞p38MAPK 蛋白表达的免疫印迹图

图5 辛伐他汀对高糖刺激时各组乳鼠心肌细胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox mRNA 表达的影响

表2 高糖刺激心肌细胞后辛伐他汀对各组乳鼠心肌细胞培养液中Caspase-3 浓度的影响（μmol/L，n=6）

3 讨论

糖尿病病变过程中的并发症，尤其是心脏方面的并发症的发生机制以及治疗已引起广泛关注，成为研究热点之一。本实验通过应用高浓度葡萄糖刺激原代培养的乳鼠心肌细胞后，发现心肌细胞活力明显下降，培养液中LDH 活力明显增高，SOD 活力明显降低，表明高浓度葡萄糖引起心肌细胞发生损伤。与国内研究[2,6]结果一致。应用辛伐他汀干预后，心肌细胞活力及SOD 活力明显升高，LDH 活力明显降低，辛伐他汀抑制了高糖对心肌细胞的氧化损伤。

既往研究表明，糖尿病及其并发症 (心血管并发症，糖尿病肾病等)伴随着细胞内NADPH 氧化酶途径激活，从而发生氧化应激[7]，p38MAPK 可能在与心肌损伤和心肌重构过程有关的心脏病变时激活[8]。本研究结果表明，高糖刺激使NADPH 氧化酶亚基mRNA 表达上调，p38MAPK 蛋白表达增高，Caspase-3 表达增高，凋亡阳性细胞数增多，而辛伐他汀干预呈浓度依赖性地使NADPH 氧化酶mRNA表达降低，p38MAPK 表达降低，Caspase-3 浓度降低，凋亡阳性细胞数减少。基础和临床资料已经表明他汀类药物能够通过减轻NADPH 氧化酶源性的活性氧的产生抑制心肌细胞肥大并改善心功能。周超杰等[9]研究表明，激活的JNK 信号通路参与了STZ 诱导的糖尿病心肌病损伤过程,辛伐他汀能够缓解糖尿病心肌损伤。吕莎莎等[10]研究表明，辛伐他汀降低2 型糖尿病大鼠心肌Toll 样受体4 表达，均与本实验结果一致。孙静等[11]研究结果显示缺血后适应通过抑制心肌p38MAPK 的磷酸化而减少再灌注过程中血小板-白细胞聚集体的表达,进一步减轻缺血再灌注损伤，与本研究通路一致。Riad 等研究表明，糖尿病大鼠p38MAPK 表达增高，而在心脏特异性表达p38MAPK 负变株的转基因糖尿病大鼠的心肌细胞形态和功能明显改善，p38MAPK 激活是糖尿病心肌病心肌重构必要的通路[8]，抑制p38MAPK可以改善链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠的心功能和内皮细胞功能。

氧化应激引起心肌细胞的凋亡和坏死在心肌细胞损伤中发挥重要作用，因为心肌细胞几乎不具有再生能力，因此凋亡增加引起心肌细胞减少成为糖尿病心肌病发生发展的重要病理基础。Caspase-3 是凋亡关键效应酶，是绝大多数凋亡机制的必经共同途径，一旦Caspase-3 活化，则凋亡不可逆转，因此常测定组织Caspase-3 活性反映凋亡程度。本研究行TUNEL 染色结果显示高糖组凋亡阳性细胞数明显增加，测定培养液中Caspase-3 浓度表明高糖引起了明显的心肌细胞凋亡，与对照组相比，差异有统计学意义，这一点与Andrea 等在糖尿病患者的心室肌标本的检测结果一致，该研究发现糖尿病患者心肌细胞的凋亡是非糖尿病患者的85 倍，而坏死只有3～4 倍。以往的研究证实在糖尿病患者及STZ诱导的糖尿病大鼠心肌内均发现增多的凋亡细胞[12]；在体外培养的心肌细胞，给予高糖刺激后，细胞的凋亡指数明显增加[13]；Ghosh 等[14]也在STZ 大鼠心肌中发现Caspase-3 活性增高并伴有心脏收缩舒张功能不全；Ricci 等[15]研究表明，以25 mmol/L 浓度的高糖培养的心肌细胞凋亡明显增多，均与本研究结果一致。李凡璐[16]研究表明，辛伐他汀抑制糖尿病大鼠心肌细胞p53 和凋亡调控基因（BAX）表达、增加抗凋亡基因（BCL-2）的表达，从而抑制心肌细胞凋亡；Al-Rasheed 等[17]研究表明，辛伐他汀能够减轻糖尿病大鼠心肌氧化应激和炎症反应，预防糖尿病大鼠心脏组织学改变和胶原沉积。我们的实验结果表明辛伐他汀治疗后通过抑制NADPH 氧化酶-p38MAPK 通路降低心肌细胞Caspase-3 表达，凋亡阳性细胞数减少，从而抑制心肌细胞凋亡，对高糖损伤的乳鼠心肌细胞发挥保护作用。

综上所述，我们的实验结果证明高糖-NADPH氧化酶-p38MAPK 通路是高糖损伤心肌细胞的重要机制，并发现辛伐他汀通过抑制NADPH 氧化酶活性降低p38MAPK 蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡。本研究结果不仅为他汀类药物与糖尿病氧化应激之间的关系拓宽了认识的视野，而且将为利用他汀类药物作为防治糖尿病慢性并发症的药物临床应用提供依据。但是本研究是在细胞水平的研究，而体内存在着庞大的物质联系，他汀类药物在体内条件下的多效性作用和细胞代谢的相互关系以及对糖尿病心肌病的影响还有待于进一步研究和探索。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突