分化拮抗非编码RNA-201 对单核-巨噬细胞功能的调控研究

周海清，刘洋，陈宇，李荣霞，杨淑均，张伟丽

心脑血管疾病是危害我国居民生命健康的“第一杀手”，患病人数达2.9 亿，居总死亡率的首位[1]。动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生和发展的重要病理基础，循环血中的单核细胞迁移并黏附于活化的血管内皮细胞，浸润至内膜下层形成巨噬细胞是动脉粥样硬化的起始环节，单核-巨噬细胞通过表型转换和分泌炎症因子等机制调控动脉粥样硬化发展的各个阶段[2-3]。斑块的稳定性决定了动脉粥样硬化的危险程度，稳定斑块可不产生临床症状，而不稳定斑块发生破裂、血栓形成后，可引发冠心病、脑卒中等急性心脑血管事件[4]。因此，探究斑块稳定性的机制和分子标志物是早期预防心脑血管事件的关键。

长链非编码RNA 分子（lncRNA）是一类长度大于 200 个碱基，没有蛋白质编码潜能的核苷酸序列，在表观遗传、转录和转录后水平等多个层面调控基因达，在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中发挥着重要作用[5]。LncRNA 在动脉粥样硬化病理生理中的作用受到广泛关注。我们在冠心病易损斑块患者外周血中鉴别出一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的新的lncRNA 分子，即分化拮抗非编码RNA-201（differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR-201）。DANCR-201 是DANCR 最 重要的转录本（转录本序列号：ENST00000411630.6），位于人4 号染色体。DANCR 在表皮细胞分化过程、干细胞特性维持以及肿瘤进展中发挥重要的调控作用，影响细胞增殖、迁移和炎症反应[6-7]。DANCR-201 在动脉粥样硬化中的作用鲜有报道。本工作拟研究DANCR-201 对单核-巨噬细胞炎症反应及其功能的影响，为阐明动脉粥样硬化斑块形成的机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 细胞与试剂

实验细胞：人单核细胞白血病细胞系（THP）-1细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会）。主要试剂包括：胎牛血清、无酚红RPMI-1640 培养基（均购自Gibco 公司，美国）；RPMI-1640 培养基、牛血清蛋白和油红O 染料（均购自Sigma 公司，美国）；干扰素-γ 和白细胞介素-4（IL-4）（均购自PeproTech 公司，美国）；Lipofectamine 3000 和NBD胆固醇（22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol）（均购自Invitrogen 公司，美国）；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）和乙酰化低密度脂蛋白（均购自广州奕源生物技术有限公司，中国）；重组人载脂蛋白A1（Abcam公司，英国）；Trizol（Thermo fisher 公司，美国）；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（Takara 公司，日本）；SYBR Green qPCR Mix（上海翊圣生物科技有限公司，中国）。主要耗材包括：96 孔黑色细胞培养板（Corning 公司，美国）；TempusTMBlood RNA Tube 采血管和TempusTMSpin RNA Isolation Kit 试剂盒（均购自Applied Biosystems公司，美国）。

DANCR-201 慢病毒载体购自上海吉凯基因科技有限公司（中国），该慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，可将DANCR-201 高效导入细胞系。DANCR-201 Smart Silencer 购自广州锐博科技有限公司（中国），这是一种包括三条小干扰RNA 和三条反义寡核苷酸的混合物，靶向DANCR-201 的不同序列位点，可有效提高细胞中DANCR-201 的敲低效率。

1.2 方法

1.2.1 研究对象及分组

纳入中国医学科学院阜外医院疑为冠心病接受冠状动脉CT 检查的患者25例，年龄≥45 岁。排除血液疾病、消化性溃疡、肝肾功能不全、感染、自身免疫疾病和肿瘤患者。使用64 排螺旋CT 进行冠状动脉扫描，两名放射科医师分别对冠状动脉图像进行分析。冠状动脉粥样硬化斑块特点分型：明显区别于冠状动脉管腔，且＞1 mm2的结构被判定为动脉粥样硬化斑块[8]；斑块中CT值＞130 HU 的高密度成分≥70 %，被定义为钙化斑块[9]；易损斑块则包含脂质、纤维和钙化等成分[10]；冠状动脉无＞1 mm2斑块者为无斑块健康对照组。根据冠状动脉CT 血管造影图像，25例患者分为3组，包括无斑块健康对照组（n=10）、完全钙化斑块组（n=10）和易损斑块组（n=5）。研究已通过中国医学科学院阜外医院伦理委员会批准，所有的入选患者均已签署知情同意。

血标本来自于晨起空腹抽血。使用TempusTMBlood RNA Tube 采血管收集患者外周血2～3 ml，立即剧烈震荡15～30 s，充分混匀，随后使用TempusTMSpin RNA Isolation Kit 试剂盒提取总RNA，-80℃储存，用于全转录组测序检测。

1.2.2 单核-巨噬细胞的培养

用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养THP-1 单核细胞，并置于37℃、5% CO2的培养箱中传代。将对数生长期的THP-1 细胞以2×105/孔的密度接种于12 孔细胞培养板，用于建立M1 和M2 型巨噬细胞极化模型：在培养基中加入10 μl 佛波酯（10 ng/ml），孵育48 h后THP-1细胞分化成为M0型巨噬细胞；在M0 型巨噬细胞中加入2 μl 脂多糖（0.5 ng/ml）和2 μl 干扰素-γ（10 ng/ml），孵育24 h，使其极化为M1 型巨噬细胞（促炎型巨噬细胞）；在M0 型巨噬细胞中加入2 μl IL-4（10 ng/ml），孵育24 h，使其极化为M2 型巨噬细胞（抑炎型巨噬细胞）。

1.2.3 过表达或敲低DANCR-201 的细胞模型

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将对数生长期的THP-1 细胞以1×105/孔的密度接种于12 孔细胞培养板，感染DANCR-201 慢病毒载体，培养72 h 后使用流式细胞分选仪（FACS Aria 2 Flow Cytometry/Cell Sorting System，美国）筛选表达绿色荧光蛋白标签的THP-1 细胞，建立稳定表达DANCR-201 的细胞系。用Lipofectamine 3000转染DANCR-201 Smart Silencer，培养48 h 后，检测巨噬细胞中DANCR-201 的表达效率，建立敲低DANCR-201 的细胞模型。

1.2.4 油红O 染色实验

将对数生长期的THP-1 细胞以2×105/孔的密度接种于底部放置盖玻片的12 孔细胞培养板，每孔加入10 μl 佛波酯（10 ng/ml）诱导48 h，然后更换为含1%牛血清蛋白的 RPMI-1640 培养基，每孔加入终浓度50 μg/ml 的ox-LDL 刺激12 h，诱导分化为泡沫巨噬细胞。取出载玻片，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔冲洗，然后将载玻片置于0.3%油红O 染色液中染色2 min，接着用苏木素伊红染色液复染细胞核2 min。洗去浮色，使用甘油封片，在Leica DM6000B光学显微镜（Leica Microsystems,德国）下观察巨噬细胞的脂质吞噬能力，细胞核呈现蓝色，脂滴为红色，每孔随机拍摄5 个视野，每个视野下约20 个细胞。

1.2.5 胆固醇流出实验

将对数生长期的THP-1 细胞以1×104/孔的密度接种于96 孔细胞培养板，每孔加入1 μl 佛波酯（10 ng/ml）诱导48 h 后，更换为含0.2%牛血清蛋白的RPMI-1640 培养基，每孔加入终浓度5 μg/ml 的NBD 胆固醇和50 μg/ml 的乙酰化低密度脂蛋白，共同孵育12 h。使用无酚红RPMI-1640 培养基轻柔洗涤细胞2 次，接着每孔给予终浓度20 μg/ml 的重组人载脂蛋白A1（溶于含0.2% 牛血清蛋白的RPMI-1640 培养基中）刺激4 h，诱导细胞的胆固醇外流。吸取细胞上清培养液并保存于96 孔黑色细胞培养板中，然后在细胞中每孔加入100 μl 0.1% Triton X-100细胞裂解液，充分吹打、震荡30 min。采用Infinite M200 Pro 光栅型多功能酶标仪（Tecan,瑞士）分别检测上清培养液与细胞裂解液的荧光强度值，吸收光469 nm，发射光537 nm。胆固醇流出率用上清液荧光值除以总荧光值（上清和细胞沉淀荧光值之和）的比值乘以100%来表示。

1.2.6 实时荧光定量PCR 法检测基因表达水平

使用RNA 抽提试剂Trizol 提取巨噬细胞的总RNA，继而用逆转录试剂盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 将mRNA 逆转录为cDNA。实时荧光定量PCR 反应体系以cDNA 为模板，加入SYBR Green qPCR Mix 和引物序列，采用ABI ViiA7 System（Applied Biosystems，美国）检测基因的mRNA 表达水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，ΔΔCt 法计算基因的mRNA 相对表达量。实时荧光定量PCR 反应体系为：（1）5 μl 2×SYBR PCR mix；（2）0.5 μl 正向引物，0.5 μl 反向引物；（3）3 μl 模板 cDNA；（4）1 μl ddH2O。反应条件为：（1）94 ℃预变性3 min；（2）94 ℃变性15 s，55 ℃退火1 min，40 个循环；（3）72 ℃后延伸10 min。检测基因的引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

1.2.7 统计学分析方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。计量变量使用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DANCR-201 在易损斑块组患者的外周血中高表达

采用全转录组测序技术检测无斑块健康对照组、完全钙化斑块组和易损斑块组患者外周血中表达差异的lncRNA 分子，发现有23 个lncRNA 存在差异表达。进一步验证测序发现DANCR-201 在易损斑块组患者外周血中的表达水平显著升高，分别为无斑块健康对照组的1.6 倍和完全钙化斑块组的1.2 倍（P＜0.01，图1）。这提示其可能参与动脉粥样硬化斑块形成的病理生理过程，因此拟探究DANCR-201 是否通过调控巨噬细胞相关功能影响动脉粥样硬化斑块形成。

2.2 DANCR-201 促进单核-巨噬细胞的炎症反应

首先，通过检测M1 和M2 型巨噬细胞的标志分子确定巨噬细胞极化模型是否成功建立。结果显示，M1 型巨噬细胞标志物单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）在M1 型巨噬细胞中表达显著增高（P＜0.01），M2 型巨噬细胞标志物白细胞介素-10（IL-10）在M2 型巨噬细胞表达显著增高（P＜0.01），说明巨噬细胞极化模型成功建立（图2）。

图1 三组患者外周血中DANCR-201 表达水平比较

图2 M0、M1 和M2 型巨噬细胞的炎症因子表达水平（n=5）

采用实时荧光定量PCR 法检测慢病毒稳定过表达DANCR-201 的不同亚型单核-巨噬细胞中炎症因子表达水平。结果显示，与慢病毒过表达对照组比较，在THP-1 细胞中，DANCR-201 显著促进炎症因子MCP-1 和TNF-α 的表达水平，分别为慢病毒过表达对照组的1.5 倍和1.2 倍（P＜0.01）；反之，采用ASO 技术敲低DANCR-201 时，MCP-1和TNF-α 的表达水平显著降低（P＜0.01，图3A）。在M1 型巨噬细胞中，DANCR-201 显著抑制抗炎因子IL-10 的表达水平（P＜0.01，图3B）。在M2 型巨噬细胞中，DANCR-201 显著促进炎症因子TNF-α的表达水平，约为敲低对照组的1.5 倍（P＜0.01）；敲低DANCR-201 时，TNF-α 表达水平下降37%（P＜0.01，图3C）。

2.3 DANCR-201 调节钙化相关基因的表达（图4）

建立慢病毒稳定过表达DANCR-201 的单核-巨噬细胞系，采用实时荧光定量PCR 法检测单核-巨噬细胞中钙化相关基因的表达改变。结果显示，与对照组比较，在M1 和M2 型巨噬细胞中，DANCR-201 显著抑制Runt 相关转录因子2（Runx 2）的表达水平（P＜0.01），并同时促进骨保护素（OPG）的高表达（P＜0.05）。反之，采用ASO 技术敲低DANCR-201 时，M1 和M2 型巨噬细胞中的Runx 2表达水平升高（P＜0.01），而OPG 的表达水平下降（P＜0.01）。

2.4 DANCR-201 对单核-巨噬细胞脂质吞噬能力的影响

采用油红O 染色法观察DANCR-201 对巨噬细胞脂质吞噬能力的影响，发现过表达或者敲低DANCR-201 时，巨噬细胞脂滴形成和脂质摄取能力与对照组比较无显著差异，脂质吞噬相关基因血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体（LOX-1）、清道夫受体CD36、A1 类清道夫受体（SR-A1）的表达水平与对照组比较差异亦无统计学意义。

图3 DANCR-201 对不同类型巨噬细胞炎症反应的影响（n=5）

图4 DANCR-201 对巨噬细胞中钙化相关基因表达水平的影响（n=5）

2.5 DANCR-201 对巨噬细胞胆固醇逆转运能力的影响（图5）

采用胆固醇流出实验检测巨噬细胞胆固醇流出率，观察DANCR-201 对巨噬细胞胆固醇逆转运能力的影响。结果显示，敲低DANCR-201 对巨噬细胞胆固醇流出率无显著影响。过表达DANCR-201 可促进M1 型巨噬细胞中ATP 结合盒转运体G1（ABCG1）的表达水平增加30%（P＜0.05），而胆固醇外排相关基因如B1 类清道夫受体（SR-B1）、ATP 结合盒转运体A1（ABCA1）等表达水平差异无统计学意义。

图5 DANCR-201 对巨噬细胞胆固醇逆转运相关基因表达水平的影响（n=5）

3 讨论

动脉粥样硬化实质上是一种慢性炎症反应性疾病，单核/巨噬细胞是炎症反应的核心[11-12]。本研究通过全转录组测序技术首次发现lncRNA 分子DANCR-201 在冠状动脉易损斑块组患者外周全血中的表达水平显著高于健康对照组和钙化斑块组患者，进一步的细胞实验研究显示DANCR-201 能够促进单核-巨噬细胞释放趋化因子MCP-1 和炎症因子TNF-α 等，并显著下调钙化相关基因Runx 2的表达水平，但对巨噬细胞脂质吞噬和胆固醇逆转运能力无显著影响，提示DANCR-201 可能通过影响单核-巨噬细胞炎症反应可以促进动脉粥样硬化进程。

研究表明急性冠状动脉综合征患者的外周血MCP-1 水平显著升高，且与心血管病死亡率增高密切相关，MCP-1 高表达能够促进单核细胞大量增殖并进一步向动脉粥样硬化病变部位聚集[13-15]。TNF-α 作为一种强效炎性因子，可促进单核细胞向内皮细胞黏附，促进巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，从而影响动脉粥样硬化发展。MCP-1、TNF-α等多种炎性因子共同作用，能显著增加动脉粥样硬化晚期斑块破裂出血与血栓形成的风险，诱发急性心脑血管事件[16-17]。本研究结果显示DANCR-201在冠状动脉易损斑块组患者外周血中的表达水平升高，可促进单核细胞释放MCP-1、TNF-α。这提示DANCR-201 可能通过调控单核巨噬细胞炎症反应影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。

动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞主要分为M1促炎亚型和M2 抗炎亚型，在特定的环境下可发生相互转换进而影响斑块形成[18]。M1 型巨噬细胞在不稳定斑块中大量存在，通过分泌TNF-α、IL-1β和IL-6 等促进动脉粥样硬化发展，而M2 型巨噬细胞主要存在于较稳定的钙化斑块中，分泌抗炎因子IL-10，发挥抑制斑块形成的作用[19]。本研究中，DANCR-201 能够显著促进M1 型巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α，抑制抗炎因子IL-10 表达，同时促进M2 型巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α。这提示DANCR-201 在两种类型巨噬细胞中均发挥促炎症作用，可能影响动脉粥样硬化中晚期的发展。

此外，血管钙化是动脉粥样硬化发展中的一种常见的病理特征，管腔表面钙盐结晶聚集使斑块更易破裂形成血栓，而在动脉粥样硬化中晚期，钙化性斑块逐渐融合，形成较厚的钙化帽能够使斑块更趋于稳定，有效防止急性血栓形成，并限制斑块形成。Runx 2 是细胞成骨分化的特异性转录因子，可作为钙化形成的早期标志[20]。OPG 是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，OPG 水平升高与机体对抗血管钙化的自我保护机制密切相关[21]。我们发现在M1、M2 型巨噬细胞中，DANCR-201 可显著抑制Runx 2，并上调OPG 的表达水平，这提示其在钙化形成中发挥着重要作用。DANCR-201 在动脉粥样硬化斑块形成中的分子机制，还需实验证据。

综上所述，本研究发现DANCR-201 在冠状动脉易损斑块组患者外周血中的表达水平显著高于健康对照组和钙化斑块组患者，可促进单核-巨噬细胞释放趋化因子MCP-1 和炎症因子TNF-α 等，并显著下调钙化相关基因Runx 2 的表达水平，这提示DANCR-201 调控单核-巨噬细胞的炎症反应。该lncRNA 分子在动脉粥样硬化发生、发展中的作用机制仍需进一步深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突