宽胸理肺汤联合三子养亲汤治疗AECOPD的GC-TOFMS血清代谢组学研究∗

张 瑞 黄庆松 赵稼萤 黄雪元

（上海市嘉定区中医医院，上海 201800）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种慢性非特异性炎症性疾病［1］。痰浊壅肺证是COPD急性加重期（AECOPD）的最主要证型之一。宽胸理肺汤是上海中医药大学附属龙华医院方邦江教授治疗痰浊壅肺型AECOPD经验方，笔者在临床上应用宽胸理肺汤联合三子养亲汤治疗AECOPD取得了更好的临床疗效［2］。本研究运用气相色谱-飞行时间质谱联用（GC-TOFMS）技术观察宽胸理肺汤联合三子养亲汤治疗AEOCPD痰浊壅肺证患者的血清代谢产物变化，同时构建相关代谢通路，从代谢层面研究中药复方的可能作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 1）诊断标准：西医诊断标准和病情严重程度分级参照2016年GOLD诊断标准［3］；中医辨证分型标准按照《中药新药临床研究指导原则》［4］。2）纳入标准：符合西医诊断标准同时符合中医辨证标准的患者，患者气流受限程度根据2016年慢性阻塞性肺疾病全球倡议［3］纳入GOLD 2～3级，能够完成肺功能检测，第1秒用力呼气量（FEV1%）为30%～80%，吸入支气管舒张剂后FEV1/用力肺活量（FVC%）<70%，且年龄60～80岁，病情在1周内急性加重期；经上海市嘉定区中医医院伦理委员会审查批准，所有受试者均签署知情同意书。3）排除标准：COPD并发呼吸衰竭且需要机械通气者；因肺结核、支气管哮喘、肺部肿瘤、肺间质纤维化、支气管扩张等原因导致的慢性咳喘患者；发病时有严重的心功能不全，肝、肾功能不全者，造血系统等诸脏器功能不全疾病和精神疾病者。

1.2 临床资料 选取2017年4月至2019年4月上海市嘉定区中医医院门诊及住院AECOPD患者60例，经中医辨证为痰浊壅肺证，采用随机、平行对照方法设计，按随机数字表将60例患者纳入治疗组和对照组各30例。另为进行代谢组学检测对照，本研究共纳入同期在笔者所在医院体检中心体检的健康受试者30名，年龄60～80岁。治疗组男性14例，女性16例；平均年龄（66.20±7.13）岁；病情严重程度GOLD 2 级19例，GOLD 3级11例；平均病程（16.77±6.09）年；平均BMI（21.26±3.17）kg/m2；合并高血压病者17例，2型糖尿病者16例，冠心病者10例。对照组男性16例，女性14例；平均年龄（65.47±8.43）岁；病情严重程度GOLD 2级17例，GOLD 3 级13例；平均病程（17±6.19）年；平均BMI（21.82±2.87）kg/m2；合并高血压者15例，2型糖尿病者17例，冠心病者11例。两组性别构成、年龄、病情严重程度、病程、BMI、合并症等方面资料比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。

1.3 治疗方法 纳入研究的AECOPD患者均按照诊治指南［5］进行治疗。对照组为西医基础治疗：吸氧、祛痰、平喘、抗感染等。治疗组在对照组基础上加用宽胸理肺汤联合三子养亲汤：麻黄9 g，杏仁12 g，法半夏9 g，全瓜蒌30 g，薤白12 g，橘红6 g，茯苓15 g，甘草6 g，桃仁10 g，苏子10 g，地龙9 g，白芥子 10 g，莱菔子 10 g。每日1剂，由笔者所在医院中药房煎制，分两次口服，每次100 mL，7 d为1个疗程，总共观察1个疗程。

1.4 标本采集和制备 治疗后两组患者及健康人群于清晨6∶00左右在室温下釆取静脉4 mL，留置于EDTA管中，血液样本在室温下自然凝固1 h，收集血清，3 000 r/min离心10 min后收集血浆置于1.5 mL Eppendor f管中，置于液氮萃取后转运至-80℃冰箱中保存备用。

1.5 标本检测和分析 代谢组学的检测和分析与上海百趣生物科技有限公司共同完成，包括样品的处理、GC-TOFMS测试和数据处理分析。1）仪器：Agilent 7890A GC-MS色谱仪；PEGASUS HT质谱仪，LECO；DB-5MS色谱柱，Agilent；Heraeus Fresco17冷冻离心机，Thermo Fisher Scientific；Forma 900 series超低温冰箱，Thermo Fisher Scientific。2）试剂：甲醇，CNW Tech⁃nologies；氯仿、吡啶、甲氧胺盐、L-2-氯苯丙氨酸、BST⁃FA及各化合物标准品，Adamas；FAMEs，REGIS Tech⁃nologies；纯水由Merck Millipore系统制备。3）样品处理：100 μL血清加入 4倍体积冷甲醇，再加入 10 μL L-2-氯苯丙氨酸沉淀蛋白，离心取上清液低温减压干燥；各样本分别取40 μL混合，制备混合血清进行质量控制（QC），按相同方法进行前处理；提取物用30 μL甲氧胺盐试剂，80℃孵育30 min后向每个样品中加入40 μL BSTFA溶解，70 ℃孵育90 min；之后加入5 μL FAMEs（溶于氯仿），随机顺序上机检测。4）分析条件：采用DB-5MS（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱；进样口温度280℃，不分流模式，进样量1 μL，载气（高纯氦）流速为3 mL/min；柱箱升温程序为50℃保持1 min后，以10℃/min升至310℃，保持8 min。质谱采用标准EI离子源，电离电压-70 eV，离子源温度250℃，在全扫描模式下采集数据，质量范围（m/z）50～500，扫描速率12.5 spectr/s。

1.6 统计学处理 应用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行分析，应用LECO-Fiehn Rtx5数据库对物质定性，匹配质谱及保留时间指数，将QC样本中检出率50%以下或RSD>30%的峰去除。得到的峰表输入Simca 15.0.2件进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）。通过置换检验，200次随机改变分类变量Y的排列顺序，得到不同的随机Q值后对模型有效性做进一步的检验。按照VIP>1，T检验（T-Test）P<0.05的条件进行质荷比的筛选后，通过检索在线数据库（KEGG、HMDB、PubChem）定性可能的差异性代谢物。最后对差异代谢物所在的通路进行综合分析、筛选（包含富集分析和拓扑分析），找到与代谢差异物相关性最高的关键通路。

2 结 果

2.1 各组PCA结果比较 见图1。治疗后两组患者与健康组基本处于95%置信区间，治疗组、对照组与健康组主要成分得到了分离，说明各组间代谢物存在显著差异；从得分图可见治疗组与健康组有靠拢趋势，与对照组有一定差异，说明治疗后治疗组与健康组代谢产物接近。

图1 各组PCA得分散点图

2.2 各组OPLS-DA及对模型的验证比较 见图2。治疗后两组患者与健康组的血清样品OPLS-DA图中，样本处于95%置信区间，治疗组与对照组、健康组分布区域完全分离，说明治疗组与对照组能对患者的代谢情况产生影响，且各组代谢情况存在差异。R2Y非常接近1，Q2非常接近1，表明当前模型较为真实可靠，适合解释各组之间的代谢差异和发现各组之间的差异性代谢物。置换检验建立对应的OPLS-DA模型获得随机模型的Q2值均小于原模型的Q2值；置换的Y变量比例增大，表面模型具有良好的稳健性，拟合良好。

图2 各组OPLS-DA得分散点图（左）和置换检验图（右）

2.3 两组治疗后差异代谢物变化 见表1，图3。对治疗后两组患者VIP>1的代谢物保留并进行统计t检验，P<0.05的代谢物作为差异代谢物。利用KEGG、HM⁃DB、PubChem等相关数据库进行检索，对代谢物鉴定和代谢通路分析后找到37种差异代谢物，其中12种与本研究相关有重要贡献，其中富马酸、生育酚、D-谷氨酸3种在治疗组中呈上升趋势，其余羟基丙酮、葡萄糖、琥珀半醛、亚油酸甲酯、2-脱氧-D-半乳糖、4-羟基丁酸乙酰酯、二十酸、硬脂酸、木糖9种呈下降趋势。

表1 两组差异代谢物变化趋势比较

图3 两组患者代谢物的热图

2.4 两组血浆差异性代谢物的代谢通路分析 将鉴定的12个差异性代谢物导入KEGG http：//www.ge⁃nome.jp/kegg/和 Metabo Analyst http：//www.metaboana⁃lyst.ca/数据库中构建中药复方治疗AECOPD痰浊壅肺证的相关代谢通路，总共发现15条代谢通路，主要相关的4条代谢通路，代谢通路分析的结果以气泡图所示（见图4）。按影响值从大到小依次为D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，丁酸盐代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，淀粉与蔗糖代谢，其影响值分别为0.33、0.08、0.06、0.02。见表2。

3 讨论

图4 宽胸理肺汤联合三子养亲汤治疗AECOPD痰浊壅肺证血清代谢通路富集分析

表2 代谢通路结果一览表

目前普遍的认识为AECOPD不仅与气道炎症有关，还是一个全身系统性炎症，笔者前期的研究已证明血液中某些炎症因子水平显著升高［6-7］。中医学COPD归属“肺胀”范畴，古代众多医家认为COPD的发生多由久病肺虚，痰浊潴留，每因再感外邪诱使病情发作加重，病机以痰为根本。痰浊壅肺为最常见证型之一，临床表现上，急性发作期患者咳、痰、喘及炎症明显加重，此阶段痰涎较多。宽胸理肺汤由瓜蒌薤白半夏汤、三拗汤、二陈汤3方组成，已经证明临床疗效显著［6-7］，现已进入国家中医药管理局诊疗规范指南选用方剂。笔者前期基于AECOPD痰浊壅肺证患者进行了大量中药复方临床疗效和药物作用机制方面的研究［2，6］，发现宽胸理肺汤联合三子养亲汤能更好改善AECOPD患者临床症状，减轻血清炎症反应。

本研究基于GC-TOFMS代谢组学技术来评价西医规范治疗基础上使用宽胸理肺汤联合三子养亲汤后，与单西药对照组比较，患者的代谢产物有何变化，以探讨中药复方的作用机制。结果筛选出12个差异代谢物（包括氨基酸、脂肪酸、糖），血清中上调代谢物比较有意义的是富马酸、生育酚、D-谷氨酸3种；下调物质中比较有意义的是羟基丙酮、葡萄糖、琥珀半醛、亚油酸甲酯、2-脱氧-D-半乳糖、4-羟基丁酸乙酰酯、二十酸、硬脂酸、木糖。通路富集表明差异代谢物在体内主要涉及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，丁酸盐代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、淀粉与蔗糖代谢4条代谢途径。

脂类代谢紊乱和炎症有密切的关系，游离脂肪酸可以活化巨噬细胞，吞噬脂滴，形成泡沫细胞，释放大量炎性因子，参与炎症的发生和发展过程［8］。炎症过程中，脂质分解使能源的主要来源增强，游离的脂肪酸含量增高。本试验检测出中西医结合给药后硬脂酸、二十酸、亚油酸甲酯等脂肪代谢产物较单纯西药组有回调趋势，说明中药可能是通过降低机体的脂肪氧化降解过程，减少炎症因子的释放，从而恢复AECOPD导致的机体脂肪酸代谢紊乱，达到抗炎作用的。

COPD患者在急性加重期引起急性炎症反应，炎症反应时趋化素增多，损害糖代谢过程［9］。血糖可能是影响AECOPD预后的一个新的预测因子，因血糖升高的可能原因有胰岛素抵抗、治疗时加用糖皮质激素、急性应激时升糖激素分泌增多等［10］。AECOPD患者如伴有高血糖状态时，其血清炎性反应程度明显升高，凝血功能紊乱加剧，肺功能损伤程度进一步加重［11］。亦有研究表明内毒素刺激后的小鼠较正常小鼠呈现高血糖和高血乳酸含量［12］。以上研究均证实高血糖与炎症有密切的关系。本研究结果表明加入中药治疗后可以回调葡萄糖、半乳糖、木糖含量，使糖酵解恢复。葡萄糖减少亦可能是被大量优先氧化以提供能量，使脂肪分解减少，脂肪酸减少，最终氨基酸代谢开始逐渐恢复正常。

谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，在生物机体起着重要的作用，D-谷氨酸是其衍生物。谷氨酸大部分由谷氨酸转运体（GLT-1，GLAST）摄取，被谷氨酰胺合成酶（Gs）转化为谷氨酰胺，谷氨酰胺再被转运合成谷氨酸，参与谷氨酸-谷氨酰胺循环。谷氨酰胺是体内含量最多的条件必需氨基酸之一，作为免疫系统的主要能量来源，能促进蛋白合成，在改善COPD患者营养及免疫功能上具有显著效果［13］。谷氨酰胺可促进常年肠道细胞ATP生成，是肠内能量生成的最大贡献者，并能提高机体抗氧化能力，减少氧化应激反应［14］。近期发现谷氨酰胺可抑制COPD患者炎性细胞中p38MAPK通路的活化，并下调IL-8的表达，达到抗炎作用［15］。本研究中中药干预后机体内D-谷氨酸增高，提示中药具有调节能量代谢与抗炎作用。

在丁酸盐代谢通路中4-羟基丁酸乙酰酯可转化为琥珀半醛，琥珀半醛可在琥珀酸半醛脱氢酶作用下转化为琥珀酸，后者是TCA循环的中间代谢产物，在线粒体生成ATP的过程中起关键作用。琥珀酸可以通过直接抑制PHD酶的活性，调节HIF-1α信号传导，作为炎症中的一种物质代谢信号，促进巨噬细胞中炎症的发生［16］。琥珀酸在TCA循环中可被琥珀酸脱氢酶（SDH）转化为富马酸，中西医结合组较西药对照组治疗后富马酸量增多，说明中药复方可能加强4-羟基丁酸乙酰酯转化为富马酸过程，增强SDH活性，导致琥珀酸含量消耗性减少，促进TCA循环产能，具有抑制炎症反应和改善能量代谢作用。生育酚是维生素E的水解产物。维生素E、生育酚均具有强烈的抗氧化作用，具有保护血管内皮、减少氧化自由基对血管壁破坏的作用［17-18］。COPD患者氧化应激及其引起的炎症反应程度较高，抗氧化治疗成为目前治疗的热点［19］。血中维生素E水平偏低与急性呼吸道感染程度相关［20］。中西医结合组较西药组生育酚含量升高，说明中药复方具有抗氧化应激及抗炎作用。

综上所述，本研究采用GS-MS代谢组学技术对宽胸理肺汤联合三子养亲汤干预AECOPD痰浊壅肺证患者血清内源性代谢物的规律进行研究。代谢组学检测结果提示，中药复方联合常规西药治疗后血浆代谢物与单纯西药治疗后代谢物不同，中药复方可能是通过影响能量代谢、糖代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢及提高抗氧化、抗炎作用达到治疗的作用。