蛋白质含量测定和SDS-PAGE指纹图谱的建立在乳制品营养价值研判中的应用

秦贝乐 邹昀珊 徐卓楠

摘 要：随着生活水平的提高，人们对乳制品的需求量越来越大。但普通消费者不了解其中营养蛋白的成分，无法区分不同乳制品的优劣。本研究通过紫外分光光度法和考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，比较不同乳制品中蛋白质含量，同时使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE），分析和鉴定其中的血清血蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，研判不同乳制品中蛋白含量高低和种类多少，建立蛋白质含量测定法和SDS-PAGE指纹图谱，从而判断乳制品营养价值。

關键词：乳制品;蛋白质浓度;蛋白质种类;考马斯亮蓝;SDS-PAGE

1.背景

乳制品营养丰富，市场广阔，受到各年龄段人们的欢迎，且人们对其营养成分及哪种乳制品最具营养价值感到好奇。本研究将从此现象出发，用科学方法（即用于蛋白质含量测定的考马斯亮蓝法及紫外分光光度法和用于蛋白质类型分析与鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳法）研判这六种乳制品的蛋白质含量高低和种类多少，从而建立蛋白质含量测定方法和SDS-PAGE指纹图谱，来判断乳制品营养价值，从而获得乳制品的营养价值信息。

据调查显示，现有研究仅使用一种方法（例如：直接电位法，甲醛滴定法等）进行研究，而该小组使用多种方法确定蛋白质含量。以上方法易于理解，结果直观，应用价值高。其次，研究目的不同。此前研究仅关注确定乳制品蛋白质含量的方法，而本研究从科学的角度出发选择大量乳制品样品进行研究。

根据日常生活中常见的乳制品类型进行抽样调查[4]，定量研究市场上某品牌乳制品的中有机鲜牛乳，生牛乳，发酵乳（酸奶），鲜牛乳，脱脂鲜牛乳以及风味发酵乳 （蓝莓味酸奶）中蛋白质含量，定性分析它们是否都含有血清血蛋白、酪蛋白（包含β-酪蛋白和α-酪蛋白）、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。

2.方法

2.1考马斯亮蓝法

将考马斯亮蓝G-250与不同浓度蛋白溶液（0.1mg/ml，0.2mg/ml， 0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml）混合并加入比色杯3/4处。测吸光度并绘制蛋白质浓度标准曲线。 重复测3次（样品配置：将1-6号牛奶分别稀释5倍、10倍和100倍），取各组平均值。

2.2 A280紫外可见分光光度法（UV-VIS法）

依次将10倍稀释的乳制品溶液1-6添加到比色杯中，并用UV分光光度计测量吸光度（重复测3次，取平均值）。

2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE）

将分离凝胶添加到TEMED中，混合注入玻璃板间隙中，再添加正丁醇。聚合结束后，除去液体，用去离子水洗涤凝胶上部，剩余液体用吸收纸干燥。将5ml5%浓缩凝胶插入梳子后，室温下垂直放置。当聚合时，将添加缓冲液的样品加热缩聚后，用去离子水冲洗凝胶，放入电泳槽中。混合10μL溴酚蓝分别稀释10倍和100倍。将1-6组乳制品注入并电泳，直到染料到达分离凝胶的底部。使用溶于乙醇，浓度为0.1%（W/V）的考马斯亮蓝R-250对琼脂进行染色和浸泡;加入10%（V/V）的乙醇和7.5%（V/V）的乙酸浸泡琼脂并反复洗涤以完成脱色。

3.1 标准曲线分析

考马斯亮蓝法测定A595nm处的吸光度并绘制标准曲线（如图1），得出R2 = 0.9788的拟合曲线。测量280nm处的吸光度并绘制标准曲线（如图2），得出R2 = 0.999的拟合曲线。0.9788和0.9999都接近1，因此可用于计算乳制品中的蛋白质含量。

3.2 不同乳制品中的蛋白质含量分析

如表1所示，将样品分别稀释5倍、10倍、100倍，在A595nm处测其吸光度，根据考马斯亮蓝法测的标准曲线算出每种乳制品的蛋白质含量。#1有机鲜乳制品，#2生牛乳，#4鲜乳制品，#5脱脂鲜乳制品分别稀释100倍，吸光度分别为0.585、0.935、0.515、0.205，#3发酵乳稀释10倍后吸光度为0.634。计算可得各种类乳制品蛋白质含量为：#1有机鲜乳制品10-20 mg/mL， #2 生牛乳大于100mg/mL; #3 发酵乳（酸奶）1-2 mg / mL; #4鲜乳制品10-20mg/mL。

如图3所示，稀释10倍的乳制品样品在A280nm处进行测定。10倍稀释后，#1，#2，#4和#5中测得的可溶性蛋白质含量更高。从高到低稀释10倍后，六种乳制品的蛋白质含量从低到高分别为：脱脂鲜乳制品、鲜乳制品、有机鲜乳制品和生牛乳。

3.3不同乳制品中蛋白质种类的分析

从图4中六种类型乳制品的SDS-PAGE分析和已知蛋白质成分比较（表2）可看出，除了#6所有乳制品都包含相似量的β-酪蛋白和α -酪蛋白，但从表3中可看出，#1、#2和#4β-乳球蛋白和α-乳白蛋白含量更高。α-乳清蛋白含有人体必需的大量氨基酸，例如人体必需却不能人体合成的亮氨酸和异亮氨酸。尽管所有含蛋白质的食物都含有这些，但可以看出新鲜的乳制品含量更加丰富。

  

4.结论

六种乳制品中蛋白质含量最高的是#2生牛乳，其浓度超过100 mg / mL，其次是#5脱脂鲜乳制品，然后是#4鲜乳制品和#1有机鲜乳制品。#1有机鲜乳制品蛋白质种类最丰富（包括血清蛋白，酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白），其次是#2生牛乳和#4鲜乳制品。最后是两种风味的#3和#6发酵乳（几乎不含蛋白质）。