QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽粪便中多种抗生素残留

曾 桥， 吕生华， 李 祥， 李 卓， 吴雪艳， 苏伟鹏， 王丽萍

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 3.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710021； 4.西安市食品药品检验所， 陕西 西安 710054)

0 引言

近年来，随着经济的发展和人们生活水平的提高，我国对肉制品的消费量不断增加，以猪肉、牛肉、羊肉和禽肉为代表的肉品产量逐年增长，从而带动了畜禽养殖业的迅速发展.目前，我国已成为世界上最大的畜禽养殖国，统计数据表明，2018年全国猪牛羊禽肉产量已达8517万吨.不断扩大的畜禽养殖规模对环境造成了巨大的压力，据估算，我国每年需要处理的养殖畜禽粪便在40亿吨以上.兽用抗生素在畜禽养殖过程中主要用作抗菌剂和促生长剂而直接添加到饲料中，然而，仅少部分抗生素参与体内代谢，大部分以原药的形式随粪尿直接排出体外[1].由于我国畜禽粪便产量巨大，且大部分养殖场缺乏必要的粪污处理措施，大量的粪便被随意处置而进入农田土壤和水环境中，不仅带来了恶臭等生态环境污染，而且随粪便排放到环境中的抗生素还会通过食物链进入人体，进而损害人体健康.

高温堆肥是实现畜禽粪便无害化和资源化的有效途径，通过堆肥一方面将粪便中的多种成分转化为稳定和易于被植物吸收利用的养分，同时，堆肥还有助于畜禽粪便中有害成分的降解和去除.勾长龙等[1]研究发现，高温堆肥能显著降低猪粪中四环素类抗生素的含量，且对四环素类抗性基因有一定的消减作用.林辉等[2]研究结果表明，鸡粪中磺胺药在高温堆肥14 d内降解率达100%.因此，开展对畜禽粪便以及畜禽粪便堆肥过程中基质的多种残留抗生素的检测研究对于降低生态污染风险，保护环境具有重要意义.

高效液相色谱及液相色谱-串联质谱是目前抗生素检测的主要方法[3,4]，此外，还有微生物法[5]、免疫分析技术(包括酶联免疫[5,6]、胶体金免疫层析[7])以及电化学免疫传感器[8,9]等)、可视化蛋白芯片分析技术[10]、高效毛细管电泳法[11]等.高效液相色谱作为常用方法，其检测器对干扰物屏蔽效果不佳，为了达到理想结果，往往需要更高的前处理技术和色谱分离技术.液相色谱-串联质谱较高效液相色谱法抗干扰能力强，灵敏度高，检测快速，定量和定性分析更准确[12,13].样品前处理是液相色谱-串联质谱法检测抗生素残留的关键步骤，QuEChERS法具有前处理简单、较高的回收率、结果准确、减少操作过程中人与有害溶剂的接触等优点[14]，目前已在食品抗生素残留检测中得到了广泛的应用，但用于检测畜禽粪便中抗生素残留的报道较少.

本文采用QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法，建立畜禽粪便中多种残留抗生素的定性定量测定方法，该方法准确，灵敏度高，操作简单，重复性好，具有良好的应用前景和广泛的应用范围.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸土霉素(≥ 98.75%)、盐酸四环素(≥ 99.60%)、磺胺嘧啶(≥ 99.22%)、诺氟沙星(≥ 99.70%)，购于上海阿拉丁化学试剂有限公司；磺胺甲嘧啶(≥ 99.70%)、氧氟沙星(≥ 95.70%),购于德国DR.E公司.

乙腈、甲醇,色谱纯，Fisher公司；乙二胺四乙酸二钠(色谱级)、甲酸、乙酸铵(质谱级),上海阿拉丁化学试剂有限公司；QuEChERS Cleanert LipoNo管,天津博纳艾吉尔科技有限公司.

1.2 仪器与设备

Ulimate3000-TSQ Quantiva 超高液相色谱-质谱联用仪，赛默飞世尔科技有限公司；KH5200DE医用数控超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司；Milli-Q Integral 5 纯水机，密理博有限公司；ME204E 万分之一电子天平、MS105 十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；TL5R 离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；FD5-2.5 真空冷冻干燥机，美国SIM国际集团有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别准确称取各抗生素标准品适量，用甲醇溶解，配制500μg/mL的单一标准品储备液，-18 ℃保存.准确量取盐酸土霉素、盐酸四环素单一标准品储备液各1 mL，量取磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、诺氟沙星单一标准品储备液各0.1 mL，共同置于10 mL棕色容量瓶内，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到浓度为50μg/mL(盐酸土霉素、盐酸四环素)和5μg/mL(磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、诺氟沙星)的混合标准品储备液，进一步吸取混合标准品储备液适量，用甲醇逐级稀释得系列浓度混合标准品工作液.

1.3.2 供试品溶液的制备

新鲜猪粪取自西安周边养殖场，经冷冻干燥后研磨并混合均匀，准确称取0.5 g干燥猪粪样品，置于50 mL离心管中，加入0.1 mol/L EDTA-2Na溶液2 mL，涡旋1 min，继续加入乙腈8 mL，涡旋1 min，超声处理15 min后，于10 000 r/min离心10 min，取上清液3 mL加入Cleanert LipoNo净化管中，振摇1 min后，静置1 min，进一步取0.1 mL上清液加2.9 mL水，涡旋1 min，稍静置后取0.5 mL上清液加2 mL水，涡旋1 min，用0.22μm聚醚砜微孔滤膜滤过，置于进样瓶中，待分析.

㉜M.Sebastiano Erizzo.Discorso sopra le medaglie degli antichi：con la dichi aratione delle monete consulari e delle medaglie degli Imperadori Romani,Venice (Varisco&Paganini),1559;Trattato di messer Sebastiano Erizzo,dell'istrumento et via inventeur de gli antichi,Venice,1554.

1.3.3 色谱-质谱条件

(1)色谱条件

色谱柱：Thermo Fisher Scientific C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm)；流动相A：0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸铵水溶液(V/V)；流动相B：0.1%甲酸乙腈(V/V)；梯度洗脱程序：0～1.0 min，5% B、1.0～1.1 min，5%～15% B、1.1～9.5 min，15%～75% B、9.5～9.6min，75% ～95% B、9.6～11.5 min，95% B、11.5～11.6 min，95%～5% B、11.5～11.6 min，5% B、流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2μL.

(2)质谱条件

采用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测(MRM)；雾化气：N2(≥ 99.9%)；碰撞气：Ar(≥ 99.99%)；雾化温度：300 ℃ ；离子传输管温度：350 ℃ ；毛细管电压：3.5 kV；鞘气流速：5 L/min；辅助气流速：8 L/min.各目标抗生素保留时间、离子对、碰撞能量、传输电压等质谱条件见表1所示.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

配制6种目标抗生素混合标准溶液，以在线流动注射方式进样，分别采用正负离子扫描模式进行检测，发现在正离子模式下进行检测时[M+H]+峰响应强度大且稳定.给予母离子不同碰撞能量，对子离子进行优化，根据响应强度选择定量和定性离子[15].优化后的质谱参数见表1.

2.2 流动相的选择

配制适当浓度6种目标抗生素混合标准溶液，分别考察0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸乙腈和水-乙腈3种流动相体系对6种目标抗生素的分离效果及质谱响应情况.结果表明，在正离子模式下，采用含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸乙腈作为流动相，峰型良好，保留时间稳定，质谱相应强度较另两种流动相体系大.因此，选择含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸乙腈作为流动相，在该条件下，6种目标抗生素提取离子流图见图1所示.

(a)盐酸土霉素

(b)盐酸四环素

(c)磺胺嘧啶

(d)磺胺甲嘧啶

(e)氧氟沙星

(f)诺氟沙星图1 各目标抗生素提取离子流图

2.3 方法学评价

2.3.1 线性相关性、检测下限和定量下限

取“1.2”节中系列浓度混合标准品工作液，按“1.3.3”节中规定的色谱条件进行测定，以各抗生素标准品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，确定相关系数(R2)，以信噪比S/N≥3 和S/N≥10 确定检测下限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表2所示.从表2可以看出，6种目标抗生素在各自线性范围内线性关系良好，R2在0.995 9～0.999 4之间.

表2 6种目标抗生素线性范围、回归方程、相关系数及检测下限、定量下限

2.3.2 精密度试验

连续进样6次，分别记录峰面积和保留时间，计算盐酸土霉素、盐酸四环素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、诺氟沙星保留时间和峰面积的RSD(n=6)，结果见表3所示，精密度良好，符合测定要求.

表3 精密度试验

2.3.3 回收率和精密度

精密称取空白猪粪样品，分别在各抗生素低、中、高三个水平下进行加样回收实验，按“1.3.2”节中要求进行处理后进行测定，计算各目标抗生素回收率和RSD，结果见表4所示.6种目标抗生素平均回收率在69.7%～119.2%，相对偏差为0.7%～10.0%(n=6)，说明方法回收率和精密度良好，能满足猪粪中抗生素残留的测定要求.

表4 6种目标抗生素回收率和精密度

2.3.4 重复性试验

精密称取猪粪抗生素阳性样品6份，按“1.3.2”节中规定的方法处理，得供试品溶液，测定条件依“1.3.3”节中规定，检出盐酸土霉素490.33 mg·kg-1(RSD=3.47%)，盐酸四环素611.02 mg·kg-1(RSD=3.45%)，磺胺嘧啶221.70 mg·kg-1(RSD=7.24%)，磺胺甲嘧啶227.30 mg·kg-1(RSD=6.35%)，氧氟沙星192.14 mg·kg-1(RSD=3.81%)，诺氟沙星160.85 mg·kg-1(RSD=6.24%)，结果表明该方法重复性良好.

2.4 实际样品测定

在西安周边8个生猪养殖场采集猪粪样本，采集好的样本保存于加冰袋的泡沫盒中，并于4 h内储存于-20 ℃冰箱，采用本实验所建立的方法进行分析.结果表明，盐酸土霉素和盐酸四环素检出率均为100%，磺胺嘧啶检出率为62.5%，氧氟沙星检出率为37.5%，诺氟沙星检出率为12.5%，磺胺甲嘧啶未检出.其中，以猪粪干基计，残留抗生素含量较高为盐酸四环素和盐酸土霉素，含量范围分别为67.82～719.74 mg·kg-1和17.48～552.74 mg·kg-1.

从结果可以发现，目标抗生素在采集的猪粪样本中检出率较高，且残留量也较大.畜禽粪便的随意排放易导致残留的抗生素对水体和环境的污染，并最终通过食物链进入人体内，对人类健康造成危害.此外，积累在环境中的抗生素作用于微生物，极易导致环境中耐药细菌和抗性基因的产生，从而对整个生态环境带来风险.因此，积极开展畜禽粪便中残留抗生素的监测和治理具有非常重要的意义.

3 结论

QuEChERS技术是基于分散固相萃取建立起来的一种样品前处理技术，具有萃取净化步骤简单，检测范围广，回收率高，分析速度快，溶剂使用量少等优点[16,17].近年来在农产品及食品加工品检测等方面应用广泛，并逐步扩大到环境、纺织等行业.本实验针对畜禽粪便中残留的常见3类(喹诺酮类、磺胺类、四环素类)6种抗生素，采用QuEChERS结合UPLC-MS/MS法对其进行定性和定量分析.

结果表明，新鲜猪粪样品经冷冻干燥，乙腈提取，Cleanert LipoNo管净化，然后采用UPLC-MS/MS检测，该方法较HLB固相萃取柱净化前处理方法简单，分析速度快，准确度和精密度均良好，可用于畜禽粪便中常见抗生素残留的分析检测.此外，本方法在净化过程中所用Cleanert LipoNo为大颗粒填料，无需离心，从而进一步简化了前处理操作[18]，适合大量样品的处理，具有较好的发展前景.