染色体微阵列分析技术在胎儿颈项透明层增厚中的应用

丁小瑞 刘爱菊 杨晓彦 张俊绘

[摘要] 染色體微阵列分析（CMA）是新近发展的产前诊断技术，凭着巨大的优势得到了广泛的应用。其优点为分辨率达到Kb级别、灵敏度和特异性高、较高程度的自动化操作以及高效率等，不仅能检测染色体数目异常及非平衡性结构异常，还能检测染色体组亚显微结构水平上不平衡重排引起的拷贝数变异（CNV）。因此，在临床检测中取得青睐，成为现在临床遗传学常规诊断的工具，并被引入到产前胎儿遗传疾病检测中。颈项透明层（NT）测量作为常规的早孕期筛查项目之一已被人们广泛采用，大量研究发现NT增厚是胎儿染色体异常的一项敏感性指标。CMA已作为产前诊断遗传筛查的一线诊断技术，在超声检测出NT异常时，染色体异常的被检出率，CMA较常规核型分析明显增高，但CMA技术可否作为产前诊断的一线检测方法目前尚不明确，在应用中特别要重视对临床意义不明的基因CNV的解释和遗传咨询。本文将对CMA技术在胎儿NT增厚中的应用、优势和面临的挑战等作一个详细的综述。

[关键词] 颈项透明层增厚;染色体微阵列分析技术;产前诊断

[中图分类号] R714.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0045-05

Application of chromosome microarray analysis in thickening of transparent layer of fetal neck

DING Xiaorui1   LIU Aiju2▲   YANG Xiaoyan2   ZHANG Junhui2

1.Graduate School， Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot   010000， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Inner Mongolia Maternal and Child Health Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot   010000， China

[Abstract] Chromosomal microarray analysis （CMA） is a newly developed prenatal diagnosis technology， which has been widely used due to its huge advantages. Its advantages are Kb level resolution， high sensitivity and specificity， high degree of automation and high efficiency etc.， it can not only detect chromosome number and unbalanced structural abnormalities， but also detect copy number variation （CNV） caused by unbalanced rearrangement at the level of chromosomal sub microstructure. Therefore， it has gained favor in clinical detection， become the tool of clinical genetic routine diagnosis， and has been introduced into prenatal fetal genetic disease detection. The measurement of nuchal translucency （NT） has been widely used as one of the routine screening items in early pregnancy. Many studies have found that NT thickening is a sensitive index of fetal chromosomal abnormalities. CMA has been used as a first-line diagnostic technique for prenatal genetic screening. In the detection rate of chromosomal abnormalities when NT abnormality is detected by ultrasound， CMA is significantly higher than that of conventional karyotype analysis. However， it is not clear whether CMA can be used as a first-line detection method for prenatal diagnosis. In application， it is necessary to pay special attention to the explanation and inheritance of gene CNV of clinical significance consultation. In this paper， we will review the application， advantages and challenges of microarray analysis in the thickening of NT.

[Key words] Thickening of nuchal transparent; Chromosome microarray analysis technique; Prenatal diagnosis

随着国家“二孩”政策的放开，孕妇年龄和环境因素的影响，新生儿的出生缺陷率也随之增加。新生儿的出生缺陷主要是由染色体异常引起的，不但影响出生人口质量，而且多数无法治愈。为了减少新生儿的先天缺陷导致的家庭和社会负担，提高人口素质，产前诊断也在以迅猛的速度发展。研究[1-2]表明，颈项透明层（nuchal translucency，NT）增厚不仅是21-三体综合征的重要标志，而且与其他染色体异常有关。因此，NT筛查已成为怀孕期间的常规检查项目之一。核型分析G显带技术已应用40年，曾经一度被认为是染色体异常诊断的“标尺”，只有非整倍体染色体数和较大的结构异常才能被检测出来，缺点是无法发现较小片段的异常，例如拷贝数变异（copy number variation，CNV），并且G显带技术材料受限，染色体亚端粒区域诊断率较低，培养时间长等，使得其作为产前诊断一线检查的地位受到挑战。自2004年染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA）应用于产前诊断以来，染色体检出率显著增高，逐渐得到广泛应用。近年来有许多学者[3-6]对NT增厚染色体正常的胎儿进行CNVs分析，所获得具有临床意义的染色体微缺失/微重复检出率为7.7%～8.3%。它可以确定异常片段的染色体核型的来源和性质，有效诊断染色体核型分析无法识别的较小片段，如染色体微缺失和微重复，从而提高染色体异常的检测成功率和诊断率。

1 NT的阐述

1.1 NT的定义

NT的厚度是指胎儿正中矢状切面，颈椎水平皮肤与结缔组织之间的半透明软组织的液体积聚的厚度，这是胎儿发育中的一种特殊声象图[7]反应在超声图上为胎儿颈部皮下组织中的无回声带。

1.2 NT增厚与胎儿染色体异常的关系

1.2.1 NT增厚与染色体核型异常的关系  1990年，NT异常会导致出现21-三体综合征被首次提出[8]。1992年Nicolaides等[9]选取827例病例进行研究，首次提出胎儿早孕期NT增厚是预测染色体异常的一个重要指标。Sun等[10]研究NT增厚与染色体异常的关系，118例病例中91.5%进行了侵入性核型分析，其中20例染色体核型是异常的，检出率为18.5%。Yang等[11]对296例NT增厚的病例进行核型分析，显示存在染色体异常的病例占19.9%。董媛等[12]研究的218例NT增厚的病例中，48例染色体异常，占总染色体异常的22.02%。刘伟明[13]研究156例NT增厚孕妇，检出染色体异常27例，且随着NT厚度的增加，核型异常发生率也增高。张春荣等[14]对61份NT增厚樣本研究，发现染色体异常11例，异常检出率为18.0%。综上表明，NT增厚与染色体核型异常有着明显的关联，可以作为产前诊断有创性筛查的依据。

1.2.2 NT增厚与染色体核型正常的关系  NT增厚，但染色体核型正常，胎儿出生缺陷的概率有多大呢？Bilardo等[15]回顾性总结，对于NT增厚但核型正常的胎儿，最终不良结果的发生率约是20%。侯莉等[16]研究NT增厚，419例胎儿行染色体核型分析，结果核型异常55例，核型正常的病例中出现自然流产或胚胎停育15例。事实上，染色体核型正常但发生不良结局的NT增厚胎儿的基因组可能发生了微小的不平衡畸变，其中微缺失和微重复是最常见的类型[17]。传统的细胞遗传学技术尚不能解决此问题，是临床咨询中的难点。因此，需要更加精细及准确的基因技术，来解决此类问题。

2 CMA技术

CMA技术又名“分子核型分析”，分为基于微阵列的比较基因组杂交aCGH技术和单核苷酸多态性SNP技术。aCGH芯片可以追踪定位DNA拷贝数量变化及其在基因组的位置。SNP芯片能检测出单亲二倍体与三倍体，对SNP基因型进行分析，提高染色体改变在亚显微层面上的分辨率和覆盖率。因此结合二者，使其优势最大程度地发挥，检测出更多有意义的临床病例。

2.1 CMA的优势及缺点

更快和更早发现胎儿缺陷是产科领域的关注重点。当常规检查检测到可疑阳性体征时，需要医院提供更精确的检测。常用的染色体检测有染色体核型分析、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、CMA等。最经典的方法是传统的染色体G显带核型分析技术，其最主要的缺点是不能发现基因组CNVs。而FISH用于单细胞分析，一次只能对几个或者一个候选位点进行检测，而且不能检测杂合子缺失（LOH）/单亲二倍体（UPD）。FISH的最大缺陷在于检测依赖探针，缺乏覆盖全基因筛查的能力。近年来研究表明，针对染色体的拷贝数变异，CMA技术能对其进行精准检测。CMA有如下优势：分辨率更高，在核型分析中，大部分被研究出来的微缺失/微重复综合征病变范围为1.5～3.5 Mb，而CMA能够发现0.1～0.3 Mb范围的微缺失/微重复病变，广泛应用于肿瘤、遗传性疾病及产前诊断等多个领域[18-19];直观准确性，明确追踪定位DNA拷贝数量变化及其在基因组的位置;不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水和绒毛膜绒毛样本;出报告速度更快，结果更加准确可靠，并且实验的流程经过标准化处置，结果应用软件系统分析，取代了主观判断，降低了人为误差[20-21];利用高密度的单核苷酸芯片检测基因组基因的多态性，鉴定LOH和UPD的分析;结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测。但是，CMA也存在一定的缺点：不能检测到染色体平衡性的结构改变级异位，不能检测点突变以上的多倍体等。最为关键的是，随着CMA技术的日新月异，凸显了我们认识水平提高缓慢的缺陷，使得临床意义不明拷贝数变异的出现，对结果的正确解读及遗传咨询成为我们最严峻的挑战[22]。

2.2 CMA在产前诊断中的应用

随着临床研究的发展，CMA应用于产前诊断一直在进行中，直至2009年，美国妇产科医师学会首次提出把CMA技术应用于产前诊断中，但附带说明：传统的常规核型分析作为主要细胞遗传学工具，CMA不能替代。2010年，CMA首次被细胞遗传学确认为检测先天性畸形或发育异常患者染色体突变的临床诊断试验[23]。2013年美国公布：如果超声检测发现胎儿结构异常，建议直接进行CMA检测，取代传统的染色体核型分析技术[24]。紧随其后，我国在2014、2016年发布了CMA应用于产前诊断及儿科遗传疾病的临床应用[25-26]。这些指南的发布，提供了CMA在中国产前诊断中的指导方针及临床地位。

2.3 CMA在NT增厚中的研究

早在2009年Law等[27]应用CMA技术在1例NT增厚但核型正常胎儿中检出16p13.11微缺失，考虑该微缺失可能会导致自闭症或智力发育迟缓。2011年Leung等[28]对NT增厚但核型正常的48例胎儿进行基于芯片的比较基因组杂交技术（aCGH）分析，4例证实为致病性CNVs。得出结论，在NT增厚且染色体核型分析正常的病例中应用CMA技术可以额外检出更多的致病性CNVs。王敏等[29]利用染色体微阵列联合核型分析对NT增厚胎儿的研究中，51例标本用SNP检测，染色体异常有20例，其中染色体核型异常11例，得出NT异常的胎儿。采用染色体核型+染色体微阵列检测，对检测染色体微缺失微重复，具有重要的产前诊断意义。李志华[30]在其研究中表明随着NT的增厚，CNV拷贝数变异发生率明显升高，用aCGH技术可以明显提高NT增厚胎儿的染色体异常检出率。薛淑雅等[31]通过染色体微阵列CMA分析374例NT增厚病例，265例（70.9%）CMA结果正常，109例（29.1%）CMA结果显示染色体异常，其中69例为常染色体数目异常，17例为性染色体数目异常，23例为拷贝数异常。由此可见，CMA技术在NT增厚的应用中，可以更多地检出有临床意义的致病性疾病，在产前诊断学科中具有重要可行性意义。

但是，也有一些学者提出相反的观点。Schou等[32]联合高分辨比较基因组杂交（HR-CGH）技术和多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术对100例早孕期NT增厚但核型正常的胎儿进行分析，结果未能检出致病性CNVs。因此认为NT增厚但核型正常胎儿中，HR-CGH和MLPA不能额外检出致病性CNVs。Scott等[33]对90例NT增厚胎儿进行分析研究，结果在41例核型正常的胎儿中仅发现1例致病性CNVs。因此认为NT增厚与致病性CNVs无关。Huang等[34]对早孕期NT增厚但核型正常的215例活产病例进行分析，其中199例未见任何其他异常，结果仅在3例中检出CNVs，且最终均考虑为临床意义不明的染色体拷贝数变异（VOUS）。未检出任何致病性CNVs，认为NT增厚可能与致病性CNVs无关，与传统细胞遗传学比较，aCGH并不能额外提高疾病检出率。

2.4 CMA结果的解读

2011年美国医学遗传学会发布了CNV解释指南，建议采用5级报告系统，即致病性的、可能致病性的、不确定的、可能良性的或良性的。这5级报告系统中数据库的不完善，给遗传咨询带来相当大的挑战，督促我们尽快提高认知水平，缓解认知与CMA技术快速发展形成的矛盾，推动CMA的发展。

总之，近30年的研究表明，“NT增厚”已被确定为胎儿结构异常的非特异性标志物，NT厚度与胎儿畸形的发生有直接关系。CMA是目前检测CNV和多态性的最佳技术。结合NT增厚，CMA可以检测到更多的染色体异常。但是CMA是否可以用于NT增厚、染色体异常的侵入性检测，以及作为产前诊断的一线检测，从2005年研究至今，只能认为CMA对微缺失/微重复的检出率有重要意义，可以作为产前诊断的标准检测，而不能得出结论作为一线检测。这就需要我们进行更大样本、更多中心、更长时间的研究来确保其在产前诊断中的地位。尽管CMA存在不足，如缺失或扩增的确切位置不能完全确定、低水平嵌合体的检出率及最受争议的VOUS的临床意义不确定性等使其在产前诊断中面临严峻挑战。但不能否认，CMA对微缺失/微重复的检出率，提高疾病的临床诊断，提供新的诊断检测方法。随着我们对数据库的不断完善，对CMA结果的认知提高，逐渐发挥CMA的优势，使其成为临床一线检测手段，造福于社会。

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