基于TLR4/NF-κB信号通路探讨何首乌提取物二苯乙烯苷对糖尿病肾病早期大鼠的影响

陈华 周迪夷

[摘要] 目的 探讨何首乌提取物对单侧肾切除联合链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病（DN）大鼠的影响。 方法60只SPF级雄性Wistar大鼠成功造模后，按照随机数字表法分为对照组，模型组，厄贝沙坦组，二苯乙烯苷（TSG）低、中、高剂量组，每组10只。各组大鼠每日灌服相应剂量的药物，对照组和模型组每日灌服相应体积的蒸馏水。记录并分析各组小鼠的各项指标。 结果 与对照组比较，模型组体重、核因子（NF）-κB抑制蛋白（IκBα）表达量显著降低，肾指数，血清肌酐（Scr）、尿素氮（UN）水平，24 h尿蛋白含量，白細胞介素（IL）-1β、IL-6和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）水平及mRNA表达，Toll样受体4（TLR4）、NF-κB p65及磷酸化（p）-IκBα蛋白表达量显著升高，肾小球受损程度较重，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，各实验组体重明显升高，Scr、UN水平，24 h尿蛋白含量，IL-1β、IL-6、MCP-1水平，TLR4、NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达水平明显下降，肾小球受损程度明显好转，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 TSG可能通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制炎性因子的生成，从而保护DN大鼠的肾脏组织。

[关键词] 何首乌;糖尿病肾病;Toll样受体4/核因子-κB;影响

[中图分类号] R587.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0021-05

Effect of tetrahydroxystilbene glucoside of Polygonum multiflorum extract on early diabetic nephropathy rats based on TLR4/NF-κB signaling pathway

CHEN Hua1   ZHOU Diyi2

1.Department of Chinese Medicine， Hangzhou Lin′an Traditional Chinese Medicine Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou   310000， China; 2.Department of Endocrinology， Zhejiang Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou   310000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Polygonum multiflorum extract on unilateral nephrectomy combined with streptozotocin （STZ）-induced diabetic nephropathy （DN） rats. Methods A total of 60 SPF male Wistar rats were successfully modeled， while divided into control group， model group， irbesartan group， tetrahydroxystilbene glucoside （TSG） low， medium and high dose groups， with 10 rats in each group. Rats were given the corresponding dose of drugs daily， while the control and the model group were infused with a corresponding volume of distilled water. Indexes of rats in each group were recorded and analyzed. Results Compared with the control group， body weight and nuclear factor （NF）-κB inhibition（IκBα） protein expression were reduced in the model group， renal index， the level of serum creatinine （Scr）， urea nitrogen （UN）， 24 h urine protein content， the levels and mRNA expression of interleukin （IL） -1β， IL-6 and monocyte chemoattractant protein 1（MCP-1）， and the protein expression of Toll-like receptor 4 （TLR4）， NF-κB p65 and phosphorylated （p）-IκBα were significantly increased， while  the glomerular damage was severe， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the model group， the weight of each experimental group was significantly increased， the levels of Scr， UN， 24 h urine protein content， IL-1β， IL-6， MCP-1， the protein expression of TLR4， NF-κB p65 and p-IκBα were significantly decreased， while the degree of glomerular damage was significantly improved， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion TSG may inhibit the formation of inflammatory factors by down-regulating TLR4/NF-κB signaling pathway to protect the kidney tissue of DN rats.

[Key words] Polygonum multiflorum; Diabetic nephropathy; Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB; Effect

糖尿病是一种复杂代谢性疾病，2013年我国糖尿病患病人数居全球首位[1]。糖尿病肾病（DN）是糖尿病的主要微血管病变，发病机制十分复杂，越来越多的证据显示[2-3]，炎症过程能加速DN发展。对于DN的治疗，目前主要是在控制患者血糖的同时使用药物调节血脂及抗氧化。然而，该方法疗效并不显著[4]。二苯乙烯苷（TSG）是何首乌的有效成分之一，具有抗炎、抗衰老、降血脂等功能[5]。前期研究显示[6]，TSG对DN具有一定的疗效，然而，具体机制仍然未知。本研究主要基于Toll样受体4（TLR4）/核因子（NF）-κB信号通路探讨TSG对DN大鼠的作用和机制，为进一步开发利用TSG提供基础的思路和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SPF级雄性Wistar大鼠，体重（150±20）g，1.4月龄，购自重庆市腾鑫生物技术有限公司，合格证号：SYXK（渝）2017-0006。浙江省中西医结合医院动物伦理委员会审核批准动物实验。

1.2 试剂

链脲佐菌素[生工生物工程（上海）有限公司，A61 0130-0100];TSG（中国药品生物制品检定所，批号：0844-200003）;厄贝沙坦（浙江华海药业股份有限公司，批号：H20000505）;白细胞介素（IL）-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、酶联免疫吸附（ELISA）测定试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号：JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0495Ra）;苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（万类生物科技有限公司，批号：20170805）;Trizol试剂盒、反转录试剂盒（赛默飞世尔生物科技有限公司，批号：12183555、N8080234）;TLR4、NF-κB p65及β-actin抗体（北京博奥森生物技术公司，批号：bs-20594R、bs-23217R、bs-0061R）;磷酸化NF-κB抑制蛋白（p-IκBα）、IκBα抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号：AF5851、AF5204）。

1.3 仪器

血糖仪（乐康全）;全自动生化分析仪检（日立7020）;生物显微镜（奥林巴斯CX23）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病肾病模型的建立  对所有大鼠进行左肾切除术。术后2周，按40 mg/kg腹腔内注射链尿佐菌素（STZ），STZ临用前用0.1 mmol/L的枸橼酸缓冲液（pH 4.4）配成浓度为2%溶液。对照组腹腔内注入等量枸椽酸缓冲液。72 h后，尾静脉采血测量血糖，连续3次血糖≥16.7 mmol/L提示造模成功[7]。

1.4.2 动物分组及处理  按照随机数字表法将大鼠分成对照组、模型组、厄贝沙坦组、TSG低、中、高剂量组。TSG低、中、高剂量组每日分别灌服TSG 10、20、30 mg/kg;厄贝沙坦组每日灌服厄贝沙坦50 mg/kg;模型组和对照组每日灌服相应体积的蒸馏水。实验周期为8周。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况  大鼠的活动、精神、毛色、食欲、排便、最后一次给药后的体重、右侧肾脏重量、肾指数[肾指数（%）=肾质量（g）/体质量（g）]等。

1.5.2 肾功能指标  用全自动生化分析仪测定24 h尿蛋白、血清肌酐（Scr）及尿素氮（UN）水平。

1.5.3 炎性因子水平  按照ELISA試剂盒说明书进行IL-1β、IL-6和MCP-1含量的检测。

1.5.4 HE染色  对肾脏组织进行HE染色，在生物显微镜下观察并分析各组大鼠肾脏组织的病理学变化。

1.5.5 RT-PCR检测  取肾皮质约100 mg，用Trizol试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA。各目的基因引物均由上海生工合成，其序列分别为（3′-5′）：①IL-1β：上游TACCTGAGCTCGCCAGTGAA，下游TTTGGTCCCTCCCAGGAAGA;②IL-6：上游TG-AACTCCTTCTCCACAAGCG，下游ATTTGTGGTTGG-GTCAGGGG;③MCP-1：上游AGATCTGTGCTGACCC-CAAG，下游TCTTCGGAGTTTGGGTTTGCT;④内参GADPH：上游ATTCCACCCATGGCAAATTCC，下游GACTCCACGACGTACTCAGC。取聚合酶链式反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分离。用凝胶成像系统分析成像，结果用目的基因片断和内参片断的条带光密度比值表示。

1.5.6 Western blot分析  取部分肾组织，用BCA法定量。取总蛋白，对其进行SDS-PAGE电泳，转膜及封闭，然后加入相应一抗，4℃下孵育过夜，然后加入相应二抗，孵育2 h后，化学发光，照相。

1.6 统计学方法

运用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析;进一步两两比较，采用LSD-t检验。以P < 0.05为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重与肾指数情况比较

与对照组比较，模型组大鼠活动度低，精神萎靡，毛色枯黄，出现弓背、进食量减少、多饮、多尿等现象;体重明显下降，肾指数明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，TSG各剂量组大鼠体重明显增加，TSG高剂量组大鼠肾指数显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1。

2.2 各组大鼠Scr、UN及24 h尿蛋白含量比较

与对照组比较，模型组Scr、UN及24 h尿蛋白含量均明显上升，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，各实验组大鼠Scr水平明显降低;除TSG低剂量组外，其他各实验组UN及24 h尿蛋白含量均明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

2.3 各组大鼠肾脏组织中IL-1β、IL-6及MCP-1水平比较

与对照组比较，模型组肾脏组织中IL-1β、IL-6及MCP-1水平明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，各实验组大鼠肾脏组织中IL-1β、IL-6及MCP-1水平明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

2.4 各组大鼠肾脏组织病理学结果比较

与对照组比较，模型组肾小球出现较多的空泡，包曼氏囊腔呈现皱缩现象，且有炎症浸润现象。与模型组比较，各实验组大鼠肾小球受损程度有所缓解，空泡较少，包曼氏囊腔皱缩程度较轻。见图4。

2.5 各组大鼠肾脏组织中IL-1β、IL-6及MCP-1 mRNA表达水平比较

与对照组比较，模型组肾脏组织中IL-1β、IL-6及MCP-1 mRNA表达量显著增加（P < 0.01）。与模型组比较，除TSG低剂量组外，其他各实验组IL-1β mRNA水平显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。厄贝沙坦组及TSG高剂量组IL-6、MCP-1 mRNA水平显著低于模型组，TSG低剂量组IL-6 mRNA水平显著高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图5。

2.6 各组大鼠肾脏组织中各蛋白表达比较

与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织中Toll样受体4（TLR4）、核因子（NF）-κB p65和磷酸化NF-κB抑制蛋白（p-IκBα）表达量显著上升，NF-κB抑制蛋白（IκBα）表达量显著下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，各实验组大鼠肾脏组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达量显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。除TSG低剂量组外，其他各实验组p-IκBα水平显著低于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。模型组与各实验组大鼠IκBα蛋白表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图6。

3 讨论

何首乌是种多年生缠绕藤本植物，其块根可入药，具有解毒、消炎等功效[8]。研究显示[9-10]，何首乌复方制剂对糖尿病及其并发症有较好的作用。TSG是何首乌的有效成分之一，有抗炎、抗衰老、降血脂等功能[11]。李彩蓉等[12]研究显示，TSG可凭借其强大的抗氧化应激能力来抑制炎性因子的表达。杨宇虹等[13]发现TSG可通过抑制Kupffer细胞的激活来减少炎症因子的表达。本研究显示，TSG可改善DN大鼠的一般情况，降低DN大鼠Scr、UN、24 h尿蛋白含量及炎性因子IL-1β，IL-6及MCP-1的表达。

TLRs是天然免疫系统中一类保守的模式识别受体，在外源微生物病原体的作用下可激活下游炎症信号通路[14-15]。在所有TLRs中，TLR4与急性肾损伤、慢性肾脏疾病和DN的发生密切相关[16]。NF-κB是TLR4信号通路的下游效应因子，可介导多种炎症过程[17-19]。研究显示[20]，活化TLRs信号可激活NF-κB活性，从而增加炎症细胞因子和趋化因子的释放，进而引起局部炎症。Mudaliar[21]认为，TLR4信号通路会影响炎症的发生，阻断其信号通路可治疗DN。本研究结果显示，TSG可有效抑制IκBα磷酸化，减少DN大鼠肾脏组织中的TLR4、NF-κB p65的表达量，降低炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表达，改善DN大鼠的病理变化，提示TSG可能通过下调TLR4/NF-κB信号通路，抑制炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的生成，从而保护DN大鼠的肾功能。

综上所述，何首乌提取物TSG对DN大鼠的肾脏组织具有保护作用，内在机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，为进一步利用何首乌提取物TSG治疗DN提供了理论依据。

[参考文献]

[1]  薛小英，高姗.1例以酮症酸中毒起病的初发2型糖尿病的护理[J].全科护理，2018，16（1）：120-123.

[2]  刘洁.2型糖尿病患者血尿酸水平与肾脏损害的相关性研究[D].石家庄：河北医科大学，2013.

[3]  方亚君，朱阿楠，许红，等.糖尿病肾病患者CX3CR1基因V249I多态性与炎症介质的关系[J].中国血液净化，2014，13（7）：515-519.

[4]  孙雅琴，王晶，李社莉.糖尿病肾病的干细胞治疗研究进展[J].廣西医学，2016，38（8）：1135-1138.

[5]  陈冰冰，姜爱玲，张岩.何首乌有效成分二苯乙烯苷的药理活性研究进展[J].中国临床药理学与治疗学，2016，21（6）：710-715.

[6]  苑天彤，刘晓民.何首乌提取物二苯乙烯苷对糖尿病肾小管损伤保护作用的实验研究[J].中国中西医结合肾病杂志，2016，17（2）：114-118.

[7]  张丽芬，吕仁和，黄文政.链脲佐菌素糖尿病肾病大鼠模型的建立及稳定性评价[J].中国比较医学杂志，2014（4）：8-12，18.

[8]  闫京训.何首乌不同栽培模式的经济效益探析[J].农技服务，2017，34（23）：56.

[9]  唐静，曾雅莉.何首乌不同提取物干预糖尿病大鼠的初步药效学分析[J].湖北中医药大学学报，2016，18（4）：35-38.

[10]  潘美秀.何首乌干预对糖尿病大鼠大脑认知功能、组织学结构的影响及可能的机制探讨[D].贵阳：贵州医科大学，2017.

[11]  李烨，周长凤，梁华.炮制工艺对何首乌成分的影响分析[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（42）：116.

[12]  李彩蓉，蔡飞，黎荣，等.二苯乙烯苷对糖尿病大鼠肾小球系膜细胞增殖及分泌炎症因子的影响[J].中药药理与临床，2010，26（2）：13-15.

[13]  杨宇虹.二苯乙烯苷上调HO-1表达负向调控H2O2诱导人脐静脉内皮细胞凋亡[D].衡阳：南华大学，2015.

[14]  王慧，官杰，罗晓庆，等.Toll样受体2与白介素-10在痤疮瘢痕形成过程中的作用及相关性[J].临床皮肤科杂志，2014，43（12）：713-715.

[15]  何倩颖，王卫星.Toll样受体4在急性胰腺炎中的作用[J].中華危重病急救医学，2018，30（12）：1206-1208.

[16]  姜燕，郑峰，夏燕平，等.Toll样受体4及肝细胞生长因子水平与急性肾损伤病变程度的关系[J].安徽医学，2018， 40（3），237-240.

[17]  刘冰熔，黄爱龙，沈鼎明.051核转录因子NF-κB—肿瘤基因治疗的新焦点[J].国际免疫学杂志，2001，24（3）：129-132.

[18]  林镇业，王志文，孟维鑫，等.TLR4/NF-κB信号通路介导的血管炎症参与A型主动脉夹层的发病机制[J].中国胸心血管外科临床杂志，2019，26（8）：748-753.

[19]  廖卫宁，杨丽，张合，等.基于TLR4/NF-κB信号通路探讨醒脑静改善反复缺血-再灌注脑损伤小鼠学习记忆能力的作用研究[J].中国医学创新，2019，16（21）：30-34.

[20]  贾禄，吉宏明，任少华，等.Toll样受体4/核因子-кB信号通路在人颅内动脉瘤形成和破裂过程中的激活[J].中国药物与临床，2016，16（9）：1274-1277.

[21]  Mudaliar H，Pollock C，Panchapakesan U. Role of Toll-like receptors in diabetic nephropathy [J]. Clin Sci，126（10）：685-694.

（收稿日期：2019-10-23  本文编辑：王晓晔）