基于网络药理学阐述青风藤对类风湿性关节炎的作用机制

丁文聪 韩隆胤 钱凯 林昌松

[摘要] 目的 通過网络药理学探究青风藤治疗类风湿性关节炎（RA）的药理机制，为RA的临床治疗提供理论依据。 方法 检索时间为建库至2018年12月，基于TCMSP、TCMID数据库搜集青风藤成分及靶点，通过Cytoscape软件构建成分-靶点网络;通过TTD、Drug Bank数据收集RA相关靶点，在STRING数据库构建靶点互作（PPI）网络。在Genomics数据库分析药物和疾病共有靶点，并利用Cytoscape软件中Cluego插件分析共同靶点的信号通路，最后构建成分-靶点-通路网络图并分析。 结果 青风藤发挥治疗RA的成分可能是拉兹马宁碱、千金藤啶碱、青藤碱等;发挥治疗作用的靶点可能包括Jun激酶（JUN）、维甲酸X受体（RXRA）、过氧化物酶体增殖活化受体γ（PPARG）等;关键作用通路包括PPAR通路、脂代谢调控、PTEN基因转录、核细胞受体及转录等13条。 结论 青风藤通过多组分、多靶点、多通路发挥镇痛消炎、减轻骨破坏等作用，对RA的治疗具有一定的价值。

[关键词] 网络药理学;青风藤;类风湿性关节炎;成分-靶点-通路网络图

[中图分类号] R593.22          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0015-06

Mechanism of Caulis Sinomenii on rheumatoid arthritis based on network pharmacology

DING Wencong1，2   HAN Longyin2   QIAN Kai2   LIN Changsong1

1.Department of Rheumatology and Immunology， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou   510000， China; 2.the First Clinical School， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou   510000， China

[Abstract] Objective To explore the pharmacological mechanism of Caulis Sinomenii in the treatment of rheumatoid arthritis （RA） through network pharmacology， and to provide theoretical basis for the clinical treatment of RA. Methods The retrieval time was from the establishment of the database to December 2018. Based on the TCMSP and TCMID database， the components and targets of Caulis Sinomenii were collected， and the component-target network was constructed through the software of Cytoscape. RA related targets were collected through TTD and Drug Bank data， and the target interaction （PPI） network was constructed in the STRING database. The common target of drugs and diseases was analyzed in Genomics database， and the signal pathway of common target was analyzed by using Cluego plugin in the software of Cytoscape. Finally， the component-target-pathway network diagram was constructed and analyzed. Results The therapeutic components of Caulis Sinomenii in the treatment of RA might be 16-epi-Isositsirikine， Stepholidine， Sinomenine， etc.; the therapeutic targets might include Jun proto-oncogene （Jun）， Retinoid X receptor alpha （RXRA）， peroxisome proliferative activated receptor gamma （PPARG）， etc.; the key pathways included PPAR pathway， lipid metabolism regulation， PTEN gene transcription， nuclear cell receptor and transcription， etc.. Conclusion Caulis Sinomenii can relieve pain and inflammation and reduce bone destruction through multi components， multi targets and multiple pathways， which has a certain value for the treatment of RA.

[Key words] Network pharmacology; Caulis Sinomenii; Rheumatoid arthritis; Component-target-pathway network diagram

类风湿性关节炎（RA）是一种常见的能引起严重畸形的慢性全身性结缔疾病，它除累及多个关节外，还可侵犯全身各处的结缔组织[1]。西医治疗对病情的缓解和改善有一定作用，但远期疗效和副作用有待观察。较多文献及古籍对中草药治疗RA都有记载，效果较好且副作用小。青风藤化学成分包含青藤碱、千金藤啶碱、木兰碱、尖防己碱等，具有抗炎、镇痛作用[2]。但其具体的活性物质基础及药理作用分子机制仍不明确。网络药理学在中药活性成分群及作用靶点、作用机制、组方规律、新适应证及新活性化合物等方面具有独特优势。本文基于网络药理学阐述青风藤对RA的作用机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 青风藤活性成分及靶点筛选

检索时间为建库至2018年12月，以“青风藤”为关键词，通过检索中药系统药理学数据库（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）搜集青风藤所有化学成分。根据药物的吸收、分布、生物转化和外排（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件，筛选出青风藤活性成分;将选取的活性成分通过Drug Bank、TCMSP数据库（https：//www.drugbank.ca/）进行靶点基因筛选，并通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）校正基因信息。

1.2 RA靶点搜集

使用Drug Bank数据库及TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）检索RA有关靶点。使用Uniprot数据库规范基因信息，研究物种为“Human”，在检索结果中删除重复的靶点，即得到RA发病机制中有关的靶点。

1.3 靶点蛋白质相互作用网络（PPI）构建

将青风藤治疗RA的预测靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），设置研究物种为“Homo sapiens”（人类），最低相互作用评分为中等可信度（0.4～0.7），隐藏离散靶点，其他参数保留默认值，得到PPI网络。最后，利用R脚本对STRING数据库中获取的靶点之间的相互作用进行计数排序，从而得出疾病的核心靶点。

1.4 青风藤“成分-靶点网络”

将青风藤成分和靶点导入可视化软件Cytoscape（http：//cytoscapeweb.cytoscape.org/）中，构建青风藤成分-靶点网络，并进行网络拓扑分析。靶点度值是拓扑结构中的重要参数之一，表示网络与节点连接的路径数，可用于评估青风藤成分和靶点的重要性。

1.5 共同靶点筛选

通过Genomic（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）数据库，取成分靶点与RA靶点交集，得到青风藤和RA的共有靶点。

1.6 “成分-靶点-通路网络”建设与分析

采用Cytoscape软件中ClueGO插件进行KEGG信号通路富集分析，构建成分-靶点-通路网络图，并使用网络分析工具明确重要成分、靶点和路径。

2 结果

2.1 RA靶点排列

通过对Drug Bank和TTD数据库检索，分别收集到161个和100个靶点，合并后共获得241个靶点。根据节点的Degree得到度值相关靶点排列。见表1。

2.2 青风藤成分及靶点

通过TCMSP数据库，根据设置的ADME条件，青风藤中包含7个成分和118个靶点，主要活性成分见表2。

2.3 中药“成分-靶点网络”

2.3.1 PPI网络构建  为明确青风藤中靶蛋白的相互作用，将上述通过筛选得到的靶蛋白在STRING平台构建PPI网络模型，见图1。

2.3.2 成分-靶点网络的构建  成分-靶点网络见图2，总共有67个节点和118条边，平均Degree为1.76。排名前4的4种成分是拉兹马宁碱、千金藤碱、β-谷甾醇和青藤碱。Degree排名前5的靶点为核受体辅激活因子2（NCOA2）、PPARG、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、PTGS2、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基，γ同种型（PIK3CG）。

2.4 疾病和成分共同靶点的筛选

通过Genomics数据库收集中药和疾病的共同靶点，共3个（JUN、RXRA、PPARG），见图3。

2.5 Cluego通路分析

通过“Cluego插件”中的KEGG、REACTOM、Wiki-Pathways数据库，筛选出5个类别和16条信号路径，见图4。其中，大多數富集于PPAR通路、脂代谢调控的通路上，而与RA存在较大关系的信号通路可能有PPAR通路、脂代谢调控、PTEN基因转录、核细胞受体与转录等13条，见表3。

2.6 成分-靶点-通路网络构建与分析

将“2.1”～“2.5”结果导入Cytoscape软件构建网络，见图5。利用网络分析工具筛选出可能发挥治疗作用的重要成分、靶点和通路。从图中可知，青风藤重要的成分很可能是拉兹马宁碱、千金藤啶碱、β-谷甾醇;重要的靶点很可能有JUN、RXRA、PPARG;重要的通路很可能是PPAR通路、脂代谢调控、PTEN基因转录、核细胞受体及转录等多条通路。

3 讨论

根据PPI网络分析，JUN、RXRA、IL-6、PPARG等可能为RA关键靶点。研究表明，细胞因子网络失调与RA发病密切相关。PPARG与RA炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表达相关，可能与RANK/OPG系统介导的破骨细胞形成及活化来抑制RA骨破坏相关[3]。IL-6在活动期RA患者血清和受累关节的滑液中浓度升高，高浓度的IL-6可诱导血管翳的形成，激活破骨细胞，使破骨细胞与成骨细胞关系失调，导致关节骨破坏[4]。另外，有研究发现，RA患者的炎症活性、贫血和生理功能可能与脂蛋白的代谢有关[5]。已证实JUN参与细胞凋亡、增殖、代谢、运动和其他细胞生命过程，其功能障碍被认为与多种疾病和病理损害密切相关[6]。

根据中药“成分-靶点网络”分析，关键成分可能为拉兹马宁碱、千金藤啶碱、β-谷甾醇和青藤碱。青藤碱具有显著的镇痛、镇静、抗炎、抗癌、促组胺释放、降血压、降糖及抗心律失常等药理作用[7]，其通过抑制核转录因子的活性抑制树突状细胞的成熟和协同刺激分子的表达，影响其激活T细胞的功能而达到治疗RA的作用[8]。林明珠等[9]研究表明，β-谷甾醇与体内的IL-6水平相关，促进细胞凋亡，对于RA的疾病活动有直接的联系。金国章[10]研究表明，千金藤啶碱可以激活大脑中的抗痛觉调制系统，抑制脊髓背角通过下行通路传递疼痛信息，发挥中枢镇痛的生理活性。此外，核心靶点可能是NCOA2、PPARG、PIK3CG、PTGS1、PTGS2。有研究表明，PIK3CG通路可以抑制家族性地中海热患者炎性反应[11]。PTGS1、PTGS2在体内炎性反应中起重要作用，临床使用非甾体抗炎药物通过抑制前列腺素环氧合酶和防止花生四烯酸转化来发挥抗炎镇痛作用[12]。

结果表明，PPAR通路和脂质代谢调控通路中的大多数基因均显著富集。目前的研究表明，与RA相关的信号通路很可能有PPAR通路、脂代谢调控、PTEN基因转录、核细胞受体等13条。脂代谢调控的通路在RA的炎症进程中有重要地位，其中白色脂肪组织（WAT）不仅是人体脂肪的储备，在维持人体内环境平衡方面起着重要作用，人体的WAT还产生50多种脂肪因子，通过内分泌和旁分泌的方式参与人体的各种病理生理过程[13]。脂代谢过程亦调控着瘦素的分泌，瘦素可促进Th1细胞的活性而抑制调节性T细胞（Treg）的增殖[14]。实验证明，脂联素能促进RA患者成骨细胞分泌更多的促炎因子，从而刺激破骨细胞分泌白介素-8（IL-8）以增加骨质破坏。脂联素促进破骨细胞中基质金属蛋白酶（MMP）的表达，这有助于基质降解[15]。内脏脂肪素可以刺激CD14+单核细胞，通过MEK1和p38信号通路分泌IL-6、IL-1β、TNF-α，并刺激淋巴细胞增殖，促进炎症指标的升高[16]。不同于基因富集的通路，PTEN亦在抑制细胞生长、促进细胞凋亡中起著关键作用。研究表明，RA患者中成纤维细胞样滑膜细胞（RA-FLS）中的PTEN呈低表达，可能造成下游Akt（Thr308）磷酸化水平上升，并引起大鼠RA FLS中的Akt磷酸化水平下降，血管内皮生长因子产生减少，FLS凋亡增加，减轻炎症环境[17]。另有研究表明，孤儿核受体γt（RORyt）是Th17细胞特异性的一种转录因子，可有效调控白介素-17（IL-17）的分泌[18]。在RA进展中，Th17细胞是CD4+辅助T细胞亚型，不同于Th1和Th2细胞亚型，可产生促炎性细胞因子IL-17[19]。此外，RA的发病与破骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞等凋亡过程密切相关[20]。其中破骨细胞在RA骨破坏的病理过程中起关键作用，多种细胞因子参与破骨细胞的形成和活化[21]。

综上所述，青风藤治疗RA的药理学机制是通过多组分、多靶点、多通路实现其镇痛消炎、减轻骨破坏的目标，从网络药理学上更加证实青风藤治疗RA具有一定的价值。

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（收稿日期：2020-01-06  本文编辑：李亚聪）