流动注射-化学发光法测定饲料中环丙氨嗪

李献锐，王 娜，王贝贝，籍雪平*，刘学锋

(1.河北医科大学药学院，河北石家庄 050017；2.河北医科大学基础医学院，河北石家庄 050017)

环丙氨嗪(Cyromazine，CYR)又名灭蝇胺，它是一种三嗪类昆虫生长调节剂，可以抑制双翅目及部分鞘翅目昆虫幼虫的生长发育和羽化[1,2]，被广泛添加到动物饲料中以控制动物厩舍内蝇蛆的生长发育。然而毒理学研究证明，环丙氨嗪能导致动物的乳房肿瘤，其代谢产物三聚氰胺能够引起膀胱肿瘤[3]。若环丙氨嗪长期被用做饲料添加剂，容易导致动物源性食品中药物残留超标，影响人民身体健康[4]。世界各国均制定了严格的饲料添加浓度和畜产品中的最高残留限量[3,5,6]。有关环丙氨嗪的分析方法有荧光法[2]侧流免疫层析法[3]、高效液相色谱法[4,7]、液相色谱-串联质谱法[8,9]、气相色谱-质谱法[10]、核磁共振法[11]等。

流动注射-化学发光法因其具有仪器简单、易于实现自动化、灵敏度高及干扰小等优点，近年来在药物分析、生化分析等领域的应用日趋活跃[12]。唐晓爽等[13]和丁彦庭等[14]利用流动注射-化学发光法测定了奶粉中的三聚氰胺，而用化学发光法测定环丙氨嗪含量的方法未见报道。本实验研究了环丙氨嗪对K3[Fe(CN)6]-鲁米诺体系化学发光行为的影响。研究发现，环丙氨嗪可使该体系发光信号增强，结合流动注射技术，建立了一种简单、灵敏的测定环丙氨嗪的新方法，并应用于饲料中环丙氨嗪的分析测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

IFFS-A型多功能化学发光检测器(西安瑞迈公司)；IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈公司)；F-7000型荧光分光光度计(日本，日立公司)；TU-1901型紫外-可见分光光度计(北京普析通用公司)；微型高速离心机(Sigma公司)。

环丙氨嗪标准储备溶液(100.0 mg/L)：称取10.00 mg环丙氨嗪标准品(阿拉丁公司)，用适量水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，贮存于4 ℃冰箱中，使用时用水稀释到所需浓度。鲁米诺储备溶液(1.0×10-2mol/L)：称取0.1772 g鲁米诺(阿拉丁公司)，用0.10 mol/L的NaOH溶液溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，使用时用0.03 mol/L NaOH溶液稀释。K3[Fe(CN)6]储备溶液：2.0×10-3mol/L，使用时用水稀释。所用试剂均为分析纯，水为超纯水(18 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

流动注射-化学发光(FI-CL)流程如图1所示。鲁米诺碱性溶液与K3[Fe(CN)6]溶液经过三通管混合后载入流路，待基线稳定后，通过进样阀将环丙氨嗪溶液注入到鲁米诺与K3[Fe(CN)6]的混合液流中，发生化学发光反应。记录化学发光信号，以峰高定量。

图1 流动注射化学发光分析流程示意图Fig.1 Schematic diagram of FI-CL system

1.3 样品处理

准确称取0.2000 g待测样品于小烧杯中，依次加入5 mL 1%三氯乙酸溶液和2 mL 2%Pb(Ac)2溶液，摇匀。将混合液以4 000 r/min离心5 min，吸取上清液，重复提取2次。将上清液合并，并以5 000 r/min离心5 min 后，取上清液5 mL，氮吹仪吹干后用水溶解，定容至100 mL即得样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 化学发光反应的动力学曲线

采用静态注射的方式考察了K3[Fe(CN)6]-鲁米诺-环丙氨嗪发光体系的动力学性质(图2)。由动力学曲线可以发现，从试剂混合到发光信号达到最大值大约需2～3 s的时间，随后化学发光信号逐渐降低回到基线，说明K3[Fe(CN)6]氧化鲁米诺的反应为快发光反应。将50 μL 100.0 mg/L的环丙氨嗪注入5 mL 的K3[Fe(CN)6]-鲁米诺体系中，发光强度由原来的2 900增加到7 500，表明环丙氨嗪对K3[Fe(CN)6]-鲁米诺体系的化学发光具有增敏作用。

图2 化学发光的动力学曲线Fig.2 Kinetic curve of chemiluminescence reactiona.luminol-K3[Fe(CN)6]；b.CYR-luminol-K3[Fe(CN)6].cluminol:1.0×10-5 mol/L,c(K3[Fe(CN)6]):2.0×10-5 mol/L,cCYR:1.0 mg/L.

2.2 流路参数的选择

在其它实验条件确定的情况下，分别考察了光电倍增管的负高压、混合管长度和试剂流速对信噪比的影响。结果表明，在光电倍增管的负高压为-650 V、混合管长度为10 cm、进样体积为100 μL和蠕动泵泵速在30 r/min时具有最佳的信噪比。

2.3 化学发光条件的优化

2.3.1 鲁米诺碱性介质的选择鲁米诺在碱性条件下容易被氧化。实验对比了同一浓度NaOH、Na2CO3、NaHCO3三种碱性介质对K3[Fe(CN)6]-鲁米诺化学发光体系的影响，发现在NaOH溶液中，环丙氨嗪对该发光体系具有最显著的增敏效果。因此选择NaOH作为碱性介质。

考察了不同浓度NaOH(0.005～0.2 mol/L)的影响。结果显示，随着其浓度的增大，发光信号先增强后减弱，但噪声也随之增大，根据最佳信噪比，确定NaOH的最佳浓度为0.03 mol/L。

2.3.2 鲁米诺浓度的选择发光强度的大小依赖于发光试剂的浓度。考察了鲁米诺浓度在1.0×10-8～5.0×10-5mol/L范围内对发光强度的影响。实验发现(图3)，鲁米诺浓度从1.0×10-8增大至1.0×10-5mol/L，相对发光强度明显增强,但1.0×10-5mol/L以后相对发光强度增大不太明显。因此优化鲁米诺溶液的浓度为1.0×10-5mol/L。

图3 鲁米诺浓度对相对化学发光强度(ΔI)的影响Fig.3 Effect of luminol concentration on ΔI2.0×10-5 mol/L K3[Fe(CN)6] + 0.10 mg/L CYR+ luminol from top to bottom(c luminol /10-6 mol/L):50,30,20,10,5,2,1,0.5,0.2.

2.3.3 K3[Fe(CN)6]浓度的选择考察了5.0×10-6～2.0×10-4mol/L浓度范围内的K3[Fe(CN)6]对光强的影响。结果如图4所示，当K3[Fe(CN)6]浓度为2.0×10-5mol/L时，相对发光强度达到最大值。超过2.0×10-5mol/L发光信号有所降低，因此确定K3[Fe(CN)6]的最佳浓度为2.0×10-5mol/L。

图4 K3[Fe(CN)6]浓度对相对发光信号的影响Fig.4 Effect of K3[Fe(CN)6] concentration on ΔI1.0×10-5 mol/L luminol+0.10 mg/L CYR+K3[Fe(CN)6] from top to bottom(c(K3[Fe(CN)6])/10-5 mol/L):20,15,10,5,2,1,0.5,0.2,0.1.

2.4 线性范围、灵敏度和检出限

在选定的实验条件下，环丙氨嗪在0.05～8.0 mg/L的浓度范围内与体系的发光信号呈良好的线性关系，回归方程为：ΔI=362.8c+10.68，r=0.9991，检出限为3.1×10-2mg/L。在最优条件下对1.50 mg/L的环丙氨嗪连续进行平行测定11次，相对标准偏差(RSD)为2.9%。

2.5 干扰试验

在环丙氨嗪浓度为3.0 mg/L，相对误差±5%的条件下，研究了可能共存的物质对测定的干扰情况。结果表明，1 000倍的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-，100倍的淀粉、糊精不干扰测定。

2.6 样品测定

将3份饲料样品按“1.3”方法处理，在优化实验条件下对样品进行测定，并做加标回收实验，结果见表1。

表1 饲料中环丙氨嗪的含量测定及回收率

2.7 反应机理探讨

为了探究可能的反应机理，扫描了体系中不同混合溶液的紫外吸收光谱(图5)和化学发光光谱(图6)。紫外-可见吸收光谱中环丙胺嗪在250 nm之外没有吸收，K3[Fe(CN)6]和鲁米诺混合溶液在加入环丙胺嗪前后体系的特征吸收峰没有变化，只是峰高有所增加。说明反应前后没有新物质生成，环丙胺嗪只起到催化作用。从化学发光图谱可以看到，K3[Fe(CN)6]-鲁米诺和K3[Fe(CN)6]-鲁米诺-CYR体系的最大发光波长都是425 nm，表明两个体系的发光物质相同，都是3-aminophthalate[15]。实验还发现通氮除氧，会降低增敏效果，说明环丙胺嗪的增敏效果和溶解氧有关。

图5 紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱图Fig.5 UV-Vis absorption spectrum of CL systema.cyromazine;b.K3[Fe(CN)6]-luminol；c.K3[Fe(CN)6]-luminol-cyromazine.

图6 化学发光光谱图Fig.6 Luminescence spectrum a.K3[Fe(CN)6]-luminol;b.K3[Fe(CN)6]-luminol-cyromazine.

基于以上实验结果，环丙胺嗪对K3[Fe(CN)6]-鲁米诺发光体系的增敏机理可推测如下：

3 结论

基于在碱性条件下，环丙氨嗪对鲁米诺-铁氰化钾体系发光反应具有明显的增敏作用，建立了流动注射化学发光测定环丙氨嗪的分析方法，并应用于动物饲料中的测定，取得了令人满意的结果。