高效液相色谱法同时测定减肥类保健食品中的6种成分

钟艳琴，史 莹，王丹琪，肖 双

(1.长沙医学院公共卫生学院，湖南长沙 410205；2.四川省食品安全监测与风险评估重点实验室，四川大学华西公共卫生学院，四川成都 610041)

荷叶碱来源于荷叶，是一种阿朴啡型生物碱，是荷叶中的主要降脂活性成分[1]；大黄、番泻叶、何首乌及决明子等中草药中均含有大黄蒽醌类化合物。这些中药在中国药典(2015版)[2]中都有明确的每日用量限制。蒽醌类化合物主要为大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素及大黄素甲醚，蒽醌类化合物也属于泻药中的一种，长期服用含这些蒽醌类化合物的保健品，也会引起大肠黑便病，增加肝毒性，甚至致畸和致癌[3]。因此，建立一种快速检测减肥保健食品中是否含有这些功效成分及蒽醌类化合物的含量的方法是十分必要的。

目前，对上述化合物单独测定或某一类型同时测定方法较多，主要有液相色谱法[4,5]、液质联用法[6 - 8]及毛细管电泳[9,10]等方法，但同时测定这6种功效成分的方法在国内外尚未见到。本文建立的是一种高效液相色谱同时测定减肥保健食品中的荷叶碱、大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚6种成分的分析方法，为减肥类保健食品有效成分及质量缺陷的初筛提供技术保障。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国，安捷伦)；KQ-250超声清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂)；TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂)；BSA224S分析天平(东莞康润仪器设备有限公司)。

标准品：大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚和荷叶碱(纯度均≥98.0%，成都曼斯特生物科技有限公司)；甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；H3PO4(分析纯，长沙晶康新材料科技有限公司)。实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

精密称取各标准物溶解于纯甲醇，其浓度分别为：芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚(50 μg/mL)，大黄素甲醚(40 μg/mL)，荷叶碱(100 μg/mL)。所有溶液于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 样品前处理

减肥茶及片剂样品经研磨混匀，减肥胶囊和软胶囊去壳后混匀，准确称取该样品0.1 g于8 mL 70%乙醇-水溶液中，超声提取30 min后，用70%乙醇-水溶液补充到10 mL，混匀后取1 mL该溶液于离心机上13 000 r/min离心5 min，上清液进样分析，每种样品做平行样。

1.4 色谱条件

菲罗门-Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)和0.02%H3PO4水溶液(B)(pH=2.3)。梯度洗脱条件为：0～4 min，69%A；4～20 min，69%～90%A；20～27 min，90%A；28 min，90%～69%A。流速为0.8 ml/mim，柱温25 ℃，20 μL进样分析，检测波长254 nm。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

根据待测物的性质及在参考文献报道[11 - 15]的基础上，分别比较了不同的提取溶剂，结果表明6种待测物在70%甲醇与70%乙醇两种提取剂中提取效率相当，因而选择70%乙醇作为提取溶液。比较了不同超声提取时间(15～90 min)对6种目标物提取效率的影响。结果表明随着提取时间的增加，提取效率也逐渐的增加，当达到30 min时6种待测物的提取基本上达到平衡。故本研究选择的提取条件为70%乙醇-水溶液，超声提取30 min。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 波长的选择将各种标准物进行紫外-可见波长扫描，从光谱图得出大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚和荷叶碱均在254 nm有较大的吸收，故选择254 nm作为检测波长，标准色谱图如图1所示。

图1 6种标准物的色谱图Fig.1 Chromatograms of the standard mixture of 6 compoundsPeak identifications:1.nuciferine(7.92 min);2.aloe-emodin(12.71 min);3.rhein(15.87 min);4.emodin(21.51 min);5.chrysophanol(23.35 min);6.physcion(26.39 min).

2.2.2 流动相中磷酸浓度的优化考察了不同H3PO4浓度(0.00%～0.50%)对分离的影响。当流动相体系仅为甲醇-水，芦荟大黄素与大黄酸不能完全分离，且荷叶碱的峰为平头峰；随着H3PO4浓度的增加，荷叶碱的峰形逐渐变好、出峰时间变短，而其它5种物质基本上保持不变。当H3PO4浓度为0.02%，各种物质的分离度Rs在1.5以上，且峰形尖锐对称。因此最终选择甲醇-0.02%H3PO4溶液为流动相。

2.2.3 温度的选择在流动相确定的情况下，比较了不同温度(20 ℃～50 ℃)对6种物质分离的影响，研究表明随着温度的升高各种物质出峰时间均变短，荷叶碱的峰形也逐渐的变好，而基线噪声也逐渐增大。综合考虑各种物质的分离度及峰形选择25 ℃为本研究的柱温。

2.2.4 流速的选择试验了不同流速(0.4～1.0 mL/min)对目标物分离的影响，得出随着流速的增加各种目标物出峰时间均缩短，且峰形也逐渐变好，但峰面积逐渐降低。综合考虑本文的流速选为0.8 mL/min。

2.2.5 进样量的优化考察了不同进样量(3、5、10、15、20 μL)对峰形及峰面积的影响，各种物质的峰面积随着进样体积的增加而增加。峰面积和峰形在进样量20 μL均满足条件，故选择20 μL作为进样量。

2.3 方法性能指标

2.3.1 线性范围、检出限及定量限在优化色谱条件下，以各化合物峰面积(y)为纵坐标，相应的浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。表1列出了各化合物的线性回归方程、线性范围、相关系数(R2)、检出限以及定量限。

表1 化合物的线性范围、检出限(LOD)及定量限(LOQ)

2.3.2 方法精密度与准确度向某一粉剂样品中分别加入(低、中、高)三个不同浓度的混合标准溶液，用1.3方法处理后，同天内重复测定6次以及连续6 d测定，如表2所示，各种目标化合物的日内精密度为0.79%～6.3%，日间精密度为0.90%～8.1%，加标回收率为62.5%～115.0%。

表2 方法的精密度与准确度

2.3.3 基质效应选择在某一胶囊样品中加入(低、中、高)3种不同浓度的混合标准溶液用来评价该方法的基质效应，该样品中的基质效应在79.5%～107.5%之间，可以忽略[16]。

2.4 样品分析

应用本法对随机从药店购买的8种样品中的目标物进行了测定，结果如表3所示。从表3中可见在8种减肥类保健品中均检测出大黄类化合物，其中2种样品中同时检测出荷叶碱与大黄类化合物。

表3 8样品中6种物质检测的结果

3 结论

建立了同时测定减肥类保健食品中6种功效成分(荷叶碱、大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚)的高效液相色谱法。方法精密度和加标回收率等性能指标良好，且样品处理方法简单，并成功应用到不同剂型(茶、片剂、胶囊、软胶囊)样品的分析测定。