miR-183靶向DDR1调控乳腺癌细胞迁移侵袭的分子机制

朱明珍 许瑾 徐静 徐海燕 李秀翠 李德凡 邵华

(1连云港市第二人民医院肿瘤科，江苏 连云港 222000； 2南京医科大学康达学院基础医学部；3连云港市第二人民医院甲乳外科)

乳腺癌是世界上最常见的女性恶性肿瘤之一，居世界女性癌症死亡率第二位〔1〕。调查显示，中国女性乳腺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势，其增长速度远高于发达国家〔2〕。乳腺癌晚期极易发生肝肺转移，预后极差〔3〕。因此，精准靶向治疗的研究对乳腺癌患者具有重大意义。miRNA为内源性短链非编码小RNA，其长度为19～23个核苷酸，参与细胞的生物学过程，调控细胞内稳态及各种信号通路〔4〕。研究证实，miRNA参与各种癌症的恶性进程，发挥抑癌或促癌作用〔5〕。miR-183在多种癌症中均出现异常表达，包括乳腺癌〔6〕。但miR-183在乳腺癌中的作用机制尚未十分清楚。盘状结构域受体(DDRs)包括DDR1、DDR2，在细胞增殖、黏附及基质重塑中具有重要作用〔7〕，尤其肿瘤细胞〔8〕。DDR1在多种癌症中均具有促进转移的作用，但其在乳腺癌中的作用机制尚未完全清楚。本研究旨在探讨miR-183在乳腺癌细胞中的功能及潜在机制。

1 材料与方法

1.1材料 人乳腺癌细胞MDA-MB-231、正常细胞MCF-10A均购自美国菌种保藏中心(ATCC)；胎牛血清购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000购自北京宜科思源科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自上海睿时生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自日本Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipor； ECL发光液购自北京康为世纪；RIPA蛋白裂解液购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京原平皓生物公司。

1.2细胞培养 人乳腺癌细胞MDA-MB-231、正常细胞MCF-10A培养时使用DMEM培养基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中进行常规培养。

1.3细胞转染 取对数增殖期的MDA-MB-231、MCF-10A细胞标记为MDA-MB-231组、MCF-10A组。用3倍量的脂质体将miR-183 mimics、miR-con、si-DDR1、si-con、miR-183+pcDNA、miR-183+pcDNA-DDR1转染至MDA-MB-231细胞，转染48 h后，通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测转染效率，确认转染成功后才可标记为miR-183组、miR-con组、si-TCF7组、si-con组，miR-183+pcDNA组、miR-183+pcDNA-DDR1组用于后续试验。若未达到理想的转染效果，则更换转染条件或质粒、DNA，再次进行转染，直至达到理想转染效率为止。

1.4qRT-PCR实验 取对数增殖期的各组细胞，按照RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒提取RNA并将其合成cDNA。用qRT-PCR试剂盒检测分析miR-183、DDR1的表达。结果用2-△△Ct计算miR-183、DDR1的表达。引物信息(5'-3')：miR-183上游引物：CGGTATGGCACTGGTAGAATTCACT；下游引物：GCTTTCCAATGCACTGACCATT；DDR1上游引物：ACTTTGGCATGAGCCGGAAC；下游引物：ACGTCACTCGCAGTCGTGAAC；内参U6和GAPDH的引物为通用引物。

1.5MTT实验 取对数增殖期的待检细胞，用培养基调整至105个/ml。取100 μl置于96孔板，再加入20 μl MTT溶液，孵育3 h后，再加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，将结晶充分溶解，在酶标仪吸收光490 nm波长下检测吸光度(A)。

1.6Western印迹实验 取对数增殖期的待检测细胞，加入蛋白裂解液充分裂解，提取总蛋白。12 000 r/min离心10 min，取上清稀释后进行沸水浴变性。用变性后的蛋白上清液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，4～5 h电泳结束。将胶上的蛋白在低温下用转膜仪转移至PVDF膜上。结束后用2.5%脱脂奶粉室温下封闭处理2 h。将膜用Ⅰ抗稀释液在4℃条件下孵育过夜。再将膜转移至Ⅱ抗稀释溶液中37℃条件下孵育2 h。最后用ECL发光试剂盒进行显影曝光。用目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值的比值表达蛋白的表示情况。

1.7Transwell实验 取对数期需要检测的细胞，用不含血清的培养基进行饥饿培养12 h，调整至105个/孔，取100 μl细胞均匀涂抹到小室的上室内，下室内加入700 μl含血清细胞培养基，培养过夜。次日，取出小室，用棉签轻轻拭去残余的细胞。将膜用甲醇固定、0.1%结晶紫染色，最后进行封片。注意封片是需要将膜的下表面向上。显微镜下观察小室下表面附着的细胞数，并计数，取平均值。注意：检测细胞迁移用的是不含基质胶的Transwell小室，而检测细胞侵袭用的是含有基质胶的Transwell小室。细胞的侵袭检测在操作步骤上完全相同，仅存在选用小室的差异。

1.8双荧光素酶报告基因检测实验 通过Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)预测DDR1与miR-183的结合位点，根据结合位点设计DDR1-3'UTR WT和DDR1-3'UTR MUT，将其克隆至荧光载体psiCHECK2上，构建荧光素酶报告质粒载体。再将其与miR-NC、miR-183共转染至MDA-MB-231细胞。按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书要求操作。记录海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性。结果以海肾荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映miR-183与DDR1的结合力。

1.9统计学处理 采用PEMS3.2软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、t检验。

2 结 果

2.1miR-183、DDR1在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达 与MCF-10A组相比，MDA-MB-231组miR-183表达显著降低，DDR1 mRNA和DDR1 蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常细胞MCF-10A中DDR1的表达

表1 乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常细胞MCF-10A中miR-183和DDR1的表达

2.2过表达miR-183抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖 与miR-con组相比，miR-183组MDA-MB-231细胞在48、72 h时细胞活性均显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 培养各时间点过表达miR-183抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖

2.3过表达miR-183抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭 与miR-con组相比，miR-183组MDA-MB-231细胞迁移量和侵袭量均显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 过表达miR-183抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭个)

2.4miR-183靶向DDR1 运用miRcode数据库预测到miR-183与DDR1 3'UTR存在结合位点(图2)；与miR-con组相比，miR-183组WT-DDR1细胞中荧光活性显著降低(表4)；miR-183能够负向调控细胞中DDR1的表达水平(P<0.05)，其中miR-con组DDR1蛋白表达为1.05±0.08，miR-183组为0.33±0.06,anti-miR-con组为1.02±0.07，anti-miR-183组为1.54±0.11，见图2。

1～4：miR-con组；miR-183组；anti-miR-con组；anti-miR-183组图2 miR-183靶向DDR1 mRNA的3'UTR

表4 双荧光素酶报告实验

2.5敲减DDR1抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭 与si-con组相比，si-DDR1组MDA-MB-231细胞DDR1蛋白表达显著降低，在48、72 h时细胞活性显著降低，细胞迁移量和侵袭量显著降低(P<0.05)。见图3，表5。

图3 检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中DDR1的表达

表5 培养各时间点敲减DDR1抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭

2.6过表达DDR1和过表达miR-183对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-con组相比，miR-183组MDA-MB-231细胞DDR1蛋白表达显著降低，在48、72 h时细胞活性显著降低，细胞迁移量和侵袭量显著降低(P<0.05)；与miR-183+pcDNA组相比，miR-183 pcDNA-DDR1组DDR1蛋白表达量显著升高，在48、72 h时细胞活性显著升高，细胞迁移量和侵袭量显著升高(P<0.05)。见图4，表6。

1～4：miR-con组;miR-183组;miR-183+pcDNA组;miR-183+pcDNA-DDR1组图4 检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中DDR1的表达

表6 培养各时间点过表达DDR1和过表达miR-183对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨 论

miRNA参与基本细胞功能的调节使其成为癌症研究的前沿，在人类许多恶性肿瘤(包括乳腺癌)中失调，表明其可能作为新型癌基因或抑癌基因参与癌症的发生发展〔9,10〕。差异表达的miRNA鉴定及其功能作用的阐明可提供针对肿瘤发生的复杂分子机制的依据〔11〕。miR-183位于染色体7q32上，是miRNA家族的一部分，在许多癌症中异常表达〔12〕。Luo等〔13〕研究发现，乳腺癌细胞中有11种差异表达的miRNA，其中表达异常降低的miRNA包括miR-183，推测miR-183在乳腺癌中具有调控作用。吴正升等〔14〕阐明，miR-183在乳腺癌中表达异常降低，且过表达miR-183可上调乳腺癌细胞侵袭力，下调迁移力，对细胞活性变化不明显，提示miR-183可能参与了乳腺癌细胞的恶性过程。Lowery等〔15〕报道，miR-183在乳腺癌中表达异常降低，且miR-183过表达可抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭，此外，miR-183靶向下调埃兹蛋白(Ezrin)，表明miR-183靶向VIL2在乳腺癌迁移和转移的调节中起重要作用。本研究发现乳腺癌细胞中miR-183异常降低，且过表达miR-183可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，与上述研究观点相符合〔13～15〕；深入研究发现，miR-183靶向负调控DDR1的表达，可能与miR-183在乳腺癌中的功能具有相关性。

DDR1也属于一类胶原受体，其在多种肿瘤中表达异常升高〔16〕，参与肿瘤细胞的EMT化，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭〔17〕。有研究报道，DDR1在乳腺癌、肝癌、肺癌中均具有促进癌症进一步恶化的作用〔18～20〕。Toy等〔21〕研究发现，DDR1在乳腺癌组织中高度表达，且定位于上皮-基质界面处，还与乳腺癌的分级和预后相关，推测DDR1在乳腺癌中具致癌作用。杨婷等〔22,23〕研究表明，DDR1可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，且其受miR-199a的负向调控抑制小鼠乳腺癌的转移。Anhao等〔24〕在三阴性乳腺癌的研究中运用Western印迹和荧光素酶报告分析发现，miR-199b-5p可靶向抑制DDR1的表达进而抑制三阴性乳腺癌的增殖、迁移和侵袭。本研究发现人乳腺癌细胞中DDR1的表达异常升高，且敲减DDR1可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭；深入研究还发现，过表达DDR1可逆转过表达miR-183对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用，说明DDR1能够恢复miR-183在乳腺癌中的功能。不足之处在于这些实验结果并未在动物体内得到进一步验证。

综上，miR-183能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制之一可能为靶向DDR1，为乳腺癌的精准治疗奠定基础。