灵芝三萜对心肌缺血大鼠心脏的保护作用

李晶 孔芳翠 于海波 于海涛 薛晴 曹翔

(佳木斯大学 1基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2附属第一医院；3临床医学院)

由于各种原因造成冠脉血流量降低而致供血不足称为心肌缺血，同时会出现营养物质与氧气供给不足，甚至出现心肌坏死和凋亡，进而影响循环系统功能，严重者会引起心肌梗死，从而致细胞外基质变化出现“失巢凋亡”。常常会同时发生心力衰竭或休克等危急重症，这些都是造成心血管疾病高死亡率、高风险、病情进展迅速的原因所在〔1〕。虽然目前经皮冠状动脉介入(PCI)〔2〕可有效缓解心肌缺血症状，重新恢复中断的血流来减轻心肌损伤，但这也是诱发心肌细胞坏死、凋亡和心力衰竭的主要原因。血供恢复后会随之出现再灌注(I/R)损伤，大多数是能量代谢紊乱、钙超载、氧自由基增加等情况出现后伴随发生的〔3〕，也称之为二次心肌损伤。这种I/R损伤又反过来促进原有心肌的损坏，相当于正反馈机制。所以造成坏死的心肌细胞面积、范围增加，长久的收缩与舒张功能障碍、心律失常等并发症的出现。现阶段针对上述问题的出现解决办法有缺血预适应和缺血后适应两种方案〔4〕。缺血后应用不同的手段给予再灌注，只是改善了血液供应，但是已经坏死、凋亡的心肌细胞却得不到修复。所以说，与心肌梗死同时发生的还有心肌细胞的丢失、心室重构等，进而进展为心力衰竭而造成患者死亡〔5〕。基于以上原因，临床医务工作者的首要任务就是寻找到既可以削弱心肌重构，又可以修复坏死、凋亡心肌的双重作用的治疗方法和药物。也就是双管齐下来控制心肌细胞的多向分化与自我更新能力。心肌缺血发生发展过程中常伴随自由基损伤及氧化应激等生化改变。黏着斑激酶(FAK)是一种下游的重要靶蛋白，能够介导整合素信号通路〔6〕，可通过阻止或抵抗一些信号分子的表达而影响细胞的正常生长发育过程，比如：细胞存活、黏附、增殖、迁移等生物过程〔7〕。由各种原因造成心肌细胞的能量代谢障碍、进而发展为心肌冠状动脉血液供应不充分，从而出现心肌细胞的衰老、破坏与死亡，即坏死和凋亡，会进一步启动心室重构，也就是自我修复过程〔8,9〕。一般在心室重构过程中常会出现心肌间质的纤维化，即激活了大量的成纤维细胞，细胞外基质的沉积及大量胶原纤维的分泌所造成的〔10〕。同时，心室重构出现的重要原因也包括氧化应激〔11〕。由于缺血缺氧的心肌会因为大量过氧化物、氧自由基的沉积增加而进一步加重心肌细胞的损伤程度〔12〕。细胞凋亡发生的同时必然伴随心肌细胞成分的缺失，而进一步加重心力衰竭的病情进展。所以说，治疗心肌缺血行之有效的方法就是削弱或抑制凋亡的心肌细胞。灵芝具有扶正固本、延年益寿、补中益气、促进新生细胞的生长、增加血液供应、加强机体免疫力等多方面药理活性。尤其是灵芝三萜这一具有诸多药理作用的活性成分在机体各器官系统都可起到调节作用，如减少组胺借以止痛、抑制肿瘤细胞的增殖、降低血压和血糖、促进细胞的新陈代谢等等。本课题通过手术方式建立心肌缺血模型，并给予灵芝三萜进行灌胃治疗，观察血清指标FAK、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的变化及心肌酶和心功能、心电图、心肌梗死面积的改变规律，探讨灵芝三萜的可能作用机制和途径，为临床寻找减轻心肌缺血药物的新靶点提供可行思路。

1 材料与方法

1.1实验动物与饲养环境 所有操作经佳木斯大学伦理委员会(批准号JMSU-227)批准后进行，30只Sprague-Dawlay大鼠(SPF级、雄性、体重220 g)购自哈尔滨医科大学实验动物研究所，合格证号SYXK(黑) 2015-001，常规喂养在佳木斯大学实验动物中心〔SYHK(黑)2016-014〕，依据3R原则给予动物人道关怀。

1.2主要试剂与仪器 灵芝三萜化合物(康道生物有限公司)；戊巴比妥钠〔施维雅(天津)制药有限公司〕；注射用青霉素(哈药集团制药总厂)；SOD、MDA试剂盒(南京建成生物公司)；FAK试剂盒(上海一基实业有限公司)；BL-420F 生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；小动物呼吸机(HX-300S，成都泰盟科技有限公司)；各类哺乳动物手术器械：如手术剪、眼科剪、镊子、止血钳、持针器、手术线、注射器、眼科开睑器、扩胸器等。

1.3动物分组与模型制备 依随机数字原则分3组：每组手术前需12 h禁食水，建立缺血模型的具体方案是：大鼠给予戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，成功后固定在自制的手术台上行术前常规的消毒、剪毛、切口等操作，然后在喉镜直视下经口气管插管，并连接小动物呼吸机(各项参数调节如下：呼吸比1∶1，潮气量15 ml)，保证大鼠的正常通气量。左胸部4、5肋间开胸结扎左前降支冠状动脉是在心电监护下完成的。呼吸平稳后连接BL-420F 生物机能实验系统描记心电图(ECG)，待基线稳定后持针器夹手术线以宽2.0 mm、厚0.5 mm距离穿过左冠状动脉前降支并结扎。出现心尖苍白变浅、ECG中可见明显抬高的ST段，即造模成功〔13〕。术毕肌注青霉素抗感染。清醒后行生理盐水灌胃28 d(常在灌胃前禁食6 h，剂量大小按120 mg/kg)。灵芝三萜组手术操作步骤同缺血组，灌胃灵芝三萜28 d。假手术组手术方案是左前降支冠状动脉仅穿线并不真正结扎，灌胃生理盐水28 d。

1.4ECG观察 以戊巴比妥钠腹腔麻醉后，固定仰卧在手术台，把5 ml注射器针头直接插在两个后肢与右侧前肢的皮下，并按如下要求连接具体电极位置：白-右前肢，红-左后肢，黑-右后肢。同时间连接好BL-420F生物机能实验系统来描记肢体标准Ⅱ导联ECG(电压1 mV=10 mm、纸速50 mm/s)。

1.5血清心肌酶检测 收集的2 ml静脉血在4℃条件下，用高速低温离心机离心10 min(速度为4 000 r/min)后，于超低温冰柜中保存备用，酶标仪测定心肌酶谱〔乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、CK-同工酶(MB)、α-羟丁酸脱氢酶(HBD)〕。操作完全依据说明进行。

1.6测血清FAK、SOD、MDA变化 试验结束后断头取血，以10 min、3 000 r/min速度离心，检测时取上清液。按试剂盒操作说明书按步骤进行。按要求处理后→分别加入平行样本、标准品及待测品稀释→加一抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记〕→孵育60 min(37 ℃)→5次磷酸盐缓冲液(PBS)洗板→加二抗(避光孵育 15 min、37 ℃)→终止液、显色液加入→测定OD 值(酶标仪、450 nm波长)。用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测血清MDA、SOD、FAK 吸光度后行单位换算。FAK、SOD、MDA试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。保证所有试剂和药品在有效期限范围内，并严格按说明书的操作步骤逐步完成。

1.7梗死面积测定 实验完成后断头处死大鼠并取下心脏，把左心室由心尖到心底部切割为每份厚2 mm组织，进行孵育(10 min、37℃、氯化三苯基四氮唑溶液)后固定(24 h、多聚甲醛)。正常心肌为红色，梗死区域为灰白色；梗死面积计算用BI-2000医学图像分析系统进行。心肌梗死面积=每片切片坏死心肌之和/整个左心室面积×100%。

1.8心功能测定 经戊巴比妥钠麻醉后，婴儿理发器胸部备皮，固定后以小动物专用彩色超声影像系统(西门子)描记二维图像，检测相关心功能指标，即左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVEDD) 及左心室收缩末期内径(LVESD)。

1.9统计学处理 应用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1ECG变化 缺血组ST段显著抬高，灵芝三萜组ST段抬高受抑制。假手术组未见明显的ST段。见图1。

假手术组

缺血组

灵芝三萜组

2.2心肌酶谱分析 缺血组LDH、CK-MB、CK、α-HBD水平明显高于假手术组(P<0.05)；灵芝三萜组上述指标明显低于缺血组(P<0.05)。见表1。

表1 各组心肌酶谱比较

2.3各组梗死面积比较 假手术组心肌没有明显的梗死〔梗死面积为(0.0±0.0)%〕，缺血组和灵芝三萜组梗死面积〔(49.86±5.17)%、(26.53±4.39)%〕均显著大于假手术组，灵芝三萜组明显小于缺血组(P<0.05)。

2.4各组血清FAK、SOD、MDA水平变化 与缺血组比，灵芝三萜组血清FAK与MDA水平显著下降，而血清SOD水平显著增加(P<0.05)；与假手术组比，缺血组血清FAK与MDA水平显著升高，而血清SOD降低水平显著(P<0.05)，见表2。

表2 各组外周血血清中FAK、SOD、MDA含量

2.5心功能比较 与假手术组比较，缺血组和灵芝三萜组LVEF显著降低，LVEDD、LVESD显著升高(P<0.05)；与缺血组比较，灵芝三萜组LVEF明显增加，而LVEDD及 LVESD明显下降(P<0.05)。见表3。

表3 各组超声心动图比较

3 讨 论

学者指出：可通过血管再生的方法促进缺血区灌注血液而强化心功能〔14,15〕。而诱发心肌梗死的主要原因为冠状动脉供血供氧不足〔16〕。通常，由于心肌供血供氧不足或需求量加大，可造成心肌缺血，从而引起心肌细胞结构变化，进而使功能、代谢失调、紊乱〔17〕。

ECG因其检查方便、简单、实用，是常用的检查方法。本研究通过结扎左前降支冠状动脉造成心肌缺血，因T波可反映出心肌缺血严重程度，故呈现出明显抬高ST段的异常ECG。灵芝三萜可减弱心肌缺血程度而发挥心保护功能。

心肌缺血发生时，可伴随大量氧自由基生成(具细胞毒性的过氧化终产物MDA)而氧化损伤脑细胞〔18〕，即MDA含量与细胞氧化应激损伤呈正相关；如SOD不断被消耗(除掉多余自由基)，即SOD含量与自由基间呈负相关，从而造成不良反应，如脑梗死〔19〕。SOD含量高低代表抗氧化水平〔20〕，反映保护细胞结构和功能完整性大小。本研究结果说明灵芝三萜可通过抑制氧化损伤，保证自由基处于动态平衡状态，降低氧化应激和心肌损伤，而起到保护心脏的作用。

在细胞凋亡过程中起作用，且在脑细胞中强表达的FAK可参与多种跨膜信号转导途径。比如其可作为去除失巢凋亡的目标，是通过整合素介导的信号传递发挥作用的。本研究结果表明，灵芝三萜可减少FAK、抑制心肌凋亡并经整合素信号通路而减弱心肌梗死；还可能是通过削弱FAK上游信号分子、降低FAK活性，调节心肌细胞膜的电压通道而发挥作用〔21〕。

灵芝三萜是灵芝孢子中发挥抗缺氧、抗癌、抗衰老、抗炎、镇痛、镇静等生物学作用的主要功效成分。三萜类有增加机体免疫力、降血压、降血糖、降血脂等作用〔22〕。综上：灵芝三萜具有降低氧化应激、减轻细胞凋亡而发挥心肌细胞保护作用。

致谢：感谢黑龙江省北药与功能食品优势特色学科建设项目资助。