胡桃醌对人胃癌细胞SGC-7901凋亡相关基因p53蛋白表达的影响

王若汗 李庆杰 成光宇 张凤清

(1长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012；2长春中医药大学附属医院)

胡桃醌(Juglone，Nuein)又名5-羟基-1,4-萘醌，是从胡桃楸新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基萘醌类化合物〔1〕，具有抗菌、降血糖、抗肿瘤等生物活性〔2〕。Zhang等〔3〕通过将不同浓度的胡桃醌与宫颈癌细胞孵育，溴化四氮唑蓝(MTT)法检测胡桃醌对宫颈癌细胞增殖的抑制作用。通过观测细胞凋亡的发生，Western印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。结果表明，胡桃醌对人宫颈癌细胞的生长有抑制作用，且呈剂量依赖性。Kiran等〔4〕通过流式细胞术分析凋亡/坏死诱导，观察到细胞存活率与胡桃醌的浓度依赖性降低，而乳酸脱氢酶水平相应升高。表明胡桃醌有可能在黑色素瘤肿瘤细胞中诱导细胞遗传学损伤。Fang等〔5〕通过MTT法分析胡桃醌对SKOV3细胞增殖的抑制作用，研究了用胡桃醌处理的SKOV3细胞的细胞周期和凋亡，通过蛋白质印迹分析法检测细胞周期蛋白D1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)，Bax、细胞色素(Cyt)c、caspase-9和caspase-3的蛋白表达水平。表明胡桃醌可以诱导人卵巢癌细胞(SKOV3)细胞凋亡，并伴有caspase-9和caspase-3活化，降低了Bcl-2水平并增加Bax和Cytc水平，并且能够充分抑制侵袭，同时明显降低基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达。本研究分析胡桃醌对人胃癌细胞SGC-7901凋亡相关基因β-蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1药品 胡桃醌单体(成都普菲德生物技术有限公司)，纯度99.1%。

1.2主要试剂 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰酶、RPMI1640培养基(Invitrogen公司)；细胞计数试剂盒8(广州市硕恒生物科技有限公司)；BeyoECL plus(上海碧云天生物技术有限公司)；MTT(Sigma公司)。

1.3细胞株 宫颈癌细胞(HELA)，SGC-7901，人肝癌细胞株(Hep-2)，人肺腺癌细胞株(A549)，乳腺癌细胞株(MCF7)，人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y-P9)均由吉林大学基础医学院分子生物学教研室提供。

1.4主要仪器 INFINITE M200酶标仪(瑞士TECAN)，IX71倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS)，MILI Q超纯水器(美国MILLIPORE)，二氧化碳培养箱(美国 THERMO)，LD5-2B离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)，BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，JB-3A恒温磁力搅拌器(雷兹互感器(上海)有限公司)，LDZX-30KBS型蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械有限公司)；高效液相色谱仪LC-20AT(日本岛津)，KQ5200DB型超声机(江苏省昆山市超声仪器有限公司)，BS110S型电子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)，T6新世纪紫外可见分光光度仪(北京普析通用)，EYELASB-2000旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

1.5细胞培养 各细胞株培养于含10% 胎牛血清(FBS)的H-DMEM培养基培养，HELA、SGC-7901、MCF-7、Hep-2、A549、SH-SY5Y-P9细胞株，37℃，饱和湿度，5% CO2培养。每周更换培养基3次，待细胞生长至对数生长期时进行细胞种板。弃去培养液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞。

1.6制备胡桃醌样品溶液 称取10 mg胡桃醌样品，加入2 ml PBS，超声机设置功率100 W，频率50 kHz，超声处理10 min，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，制成5 mg/ml样品储备液，放入冰箱冷藏保存。

1.7CCK8法筛选最适敏感菌株 取对数生长期的细胞在96孔培养板中培养，每孔加入100 μl，浓度为5×103，培养条件：37℃饱和湿度，5% CO2。培养24 h，空白孔和阴性对照孔加入培养液100 μl，样品孔加入样品溶液100 μl使终浓度为0.000 0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0、4.000 0 μg/ml每个浓度设3个复孔。置培养箱中培养48 h，加入10 μl CCK-8试剂，以只加100 μl完全培养液和CCK-8试剂作为空白对照。培养2 h，酶标仪450 nm测定各孔吸收值A。 细胞存活率=(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

1.8高通量测序与生物信息学分析 按试剂盒说明提取总RNA，通过Illumina高通量测序获取胡桃醌处理的SGC-7901和对照组细胞基因表达数据并通过R语言“DESeq2”包实现数据标准化，筛选差异表达基因的阈值设置为：|logFC|>1且P<0.05。通过R语言“ggfortify”包进行主成分分析，R语言“clusterProfiler”包用于KEGG信号通路富集分析。

1.9Western印迹方法 采用Novagen公司的Cytobnster提取SGC-7901总蛋白，提取蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶和5%浓缩胶分离，Bio-Rad的标准湿式转膜装置设置转膜电流300 mA,转膜时间40 min，转膜槽放置于冰浴中转膜，将蛋白转印至硝酸纤维素膜。用含5%脱脂奶粉1×Tween-20 Tris盐酸缓冲液(TBST)浸泡硝酸纤维素膜，室温封闭摇2 h。将封闭过的膜放于一抗稀释液中，4℃过夜。第2天吸弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5 min。稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。加入稀释好的二抗，室温旋转孵育1 h。吸弃二抗稀释液后，0.1% TBST室温下洗膜3次，每次5 min;使用BeyoECL进行染色。

1.10实时定聚合酶链反应(RT-PCR)检测p53 mRNA表达水平 按试剂盒说明提取总RNA，GAPDH，p53的引物及扩增片段长度见表1。RT-PCR按说明书进行，扩增条件:94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物用含0.5 mg/L溴化乙锭的15 g/L琼脂糖凝胶电泳进行，最后用凝胶成像系统Quanity one软件分析结果，以目的基因与GAPDH条带的相对含量比值表示。

表1 PCR引物序列和产物长度

1.11统计学方法 采用Graphpad软件进行Anova检验。

2 结 果

2.1胡桃醌对SGC-7901存活率的影响 胡桃醌对6种肿瘤细胞都有一定的抑制作用，其中对人SGC-7901半数抑制浓度为0.287 3 μg/ml，是6种肿瘤细胞中最敏感细胞，以SGC-7901进行差异基因的筛选。见图1。胡桃醌对SGC-7901活性抑制效果最为明显，且随着胡桃醌浓度的升高对细胞活性的抑制效果增强(浓度从小至大，P53/GAPDH值分别为(90.43±2.16)%、(69.86±1.49)%、(55.14±1.89)%、(45.37±1.23)%、(39.55±1.35)%、(36.26±1.79)%、(34.25±1.02)%，细胞存活率明显下降时浓度为0.125 0 μg/ml，且在胡桃醌浓度达到0.250 0 μg/ml时，细胞存活率接近50%，且组间差异显著(P<0.05)，因此选择0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 μg/ml浓度进行后期实验。

图1 不同浓度胡桃醌对6种细胞存活率的影响

2.2高通量测序差异基因筛选及生物信息学分析 通过高通量测序，获得了胡桃醌处理的SGC-7901与对照组细胞中的31 695个基因的表达数据。通过主成分分析可知，实验组与对照组基因表达差异较大。见图2。然后基于|logFC|>1且P<0.05的阈值，最终筛选得到4 248个差异表达的基因，其中2 364个差异基因显著上调，1 884个差异基因显著下调。通过火山图可视化该数据，进一步KEGG信号通路富集分析这些差异基因主要富集在酒精中毒信号通路、Hippo信号通路、Apelin信号通路及p53信号通路等。见图3、4。

图2 主成分分析

图3 差异表达基因火山图

图4 KEGG信号通路富集分析

2.3凋亡相关基因蛋白表达水平检测结果 由Western印迹结果可知，与对照组〔(98.57±3.98)%〕相比，SGC-7901凋亡相关基因p53蛋白表达水平在胡桃醌作用后显著上调，且与胡桃醌浓度呈剂量依赖关系，其表达量随着胡桃醌浓度的升高而升高(浓度从小至大，P53/GAPPH依次为〔(119.61±5.96)%、(131.75±5.21)%、(148.29±5.15)%、(156.14±4.37)%〕，组间差异显著(P<0.05)。见图5。

图5 胡桃醌对SGC-7901 p53基因影响的Western印迹结果

2.4胡桃醌对SGC-7901 p53 mRNA表达的影响 经RT-PCR方法检测，不同浓度胡桃醌诱导SGC-7901凋亡后p53基因mRNA表达水平较对照组(0.41±0.02)明显增强，且与胡桃醌浓度呈剂量依赖关系，其表达量随着胡桃醌浓度的升高而升高〔浓度从小至大，P53 mRNA/GAPDH分别为(0.51±0.02)、(0.79±0.02)、(0.83±0.02)、(0.87±0.02)，组间差异显著(P<0.05)〕。

3 讨 论

胃癌为人类常见的恶性肿瘤之一，近年来，随着人们饮食结构的变化，胃癌的发病率也大大提升〔6〕。胃癌的侵袭和转移过程，主要包括肿瘤细胞迁徙、黏附，细胞外基质降解，肿瘤血管形成等〔7〕据世界卫生组织统计，男性主要恶性肿瘤有肺癌、肝癌、胃癌；女性主要恶性肿瘤有肺癌、胃癌、肝癌。国际癌症研究机构调查显示，癌症死亡的最常见原因是肺癌(160万例死亡)，肝癌(74.5万例死亡)和胃癌(72.3万例死亡)〔8〕。虽然说过去的100多年中胃癌不是致死率最高的癌症，但其死亡率仍居于世界第二位〔9〕。

本研究基于胡桃醌处理的胃癌细胞，利用二代测序的技术，筛选胡桃醌处理的SGC-7901和对照组细胞的差异表达基因。差异程度最高的前5个上调基因与前5个下调基因被认为在胡桃醌处理后的胃癌细胞反应中可能发挥关键作用，显著上调：TRIM39-RPP21、SPATC1、PCDH17、MMP2、ANGPT1；显著下调：SPI1、GAGE12J、TNFSF12-TNFSF13、CSF3R、AC005154.6。此外，胃癌细胞对胡桃醌处理的反应与p53信号通路显著相关。因此，进一步探究p53信号通路中的分子在该过程中的变化与作用机制对胡桃醌治疗胃癌的临床实践有很大的意义。综上，胡桃醌导致SGC-7901凋亡的机制可能是诱导细胞凋亡水平而发挥的，与调节凋亡相关基因p53表达相关，该研究为临床上利用胡桃醌靶向抑制肿瘤细胞生长的方法提供了一定的科学依据。